细胞作为生命活动的基本单位,也是咱们生命科学及医学领域最重要的实验材料之一。因此,培养一窝健康生长的细胞 「宝宝」 对咱们科研人员而言,是一门必不可少的入门手艺。 然而做过的人都懂,这细胞培养虽是入门手艺,可一点都不简单呐!分分钟来个污染,尤其是微生物污染,轻则自个儿的细胞废弃,重则连累整个培养箱,甚至培养室!让人头疼不已! 那么究竟有哪些微生物会造成细胞污染呢?我们又该如何应对?今天小 P 就和大家一起总结一下~
微生物污染分类 一、细菌污染 细菌污染是细胞培养中最常见的污染,其污染主要来源于实验室环境、实验人员(实验服)、实验用具等,甚至在细胞培养过程中添加抗菌素(一般为预防剂量),也可能因为操作不慎而引起污染。
二、真菌污染 真菌污染是细胞培养过程中最常见的另一种污染,尤其在霉雨季节,霉菌污染尤为严重。另外由于真菌可以通过孢子繁殖,因此一旦污染很容易发生扩散。
三、支原体污染 支原体是一种大小介于细菌和病毒之间,并独立生活的原核微生物,广泛存在于人和动物体内。
黑胶虫是一种生物还是非生物,学术界至今还有争议。这里我们暂且将其认作是一种微生物。黑胶虫污染主要来源于血清。
病毒作为一种比支原体更小的微生物,体型在 nm 级,很难用常规方法检测到。病毒污染分为外源性和内源性,污染主要来源为细胞系,常见于杂交瘤细胞。
微生物污染预防 微生物污染在细胞培养中是非常常见的,也是令人头大的一件事情。所以我们一定要将问题扼杀于摇篮之中,规范实验中的各个步骤,确保细胞「宝宝」在无污染的情况下健康成长。 1.实验进行前,准备好所需的试剂和器材。玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1) 高压蒸汽灭菌 15 分钟以上;2) 干烤消毒 140℃ 2 小时以上。 2.培养基 (pH7.2) 和血清配制好后要做无菌试验:将血清按 10% 加入培养基内,用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基 5-10 ml 置培养箱内培养 2-3 天,肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置 4℃ 保存。 3.消化液 (pH7.8) 或其它加入液,应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌,分装成支置 - 20℃ 保存。 4.超净台用紫外灯照射 30-60 min,并开启超净台风机运转 5-10 min,然后用 75% 酒精擦拭超净台台面,再开始实验操作。 5.实验进行时,佩戴好口罩及手套,穿上洁净实验服,有长发则将长发扎起或者佩戴帽子,避免灰尘或唾液进入培养物中。 6.进入超净台前应用 75% 酒精对双手及手腕进行全面擦拭,确保除菌完全。 7.实验用品用 75% 酒精擦拭后才能放入超净台内。 8.操作时小心取用无菌物品,应避免污染。勿碰触吸管尖头,不小心碰触后应立即更换;手及物品不要在暴露的瓶口上方来往,容器打开后,倾斜 45 度操作,操作完成后及时盖上瓶盖。 9.每次操作只处理一种细胞;即使不同细胞使用相同的培养基也不要共享同一瓶培养基,避免细胞间的交叉污染。 10.实验用品用完应移出超净台,以利于空气流通;实验完成后用 75% 酒精擦拭超净台台面。 11.定期清洗或更换超净台过滤膜、预滤网。 12.此外 CO2 培养箱的清洁是较易被忽视的地方,应 1-2 个月对培养箱定期进行清洁消毒。先用 75% 酒精擦拭培养箱内壁、隔板、水盘 2-3 次,用双蒸水清洗,再用酒精棉球擦拭一遍,最后紫外灯照射 1 h 以上或进行高温高压灭菌处理。水盘内加入无菌水(应每周更换),待培养箱内温度、湿度、CO2 浓度稳定后再放入细胞。
有同学可能会问,细胞已经被污染了怎么办?还能挽救吗? 首先我们要知道,在任何情况下,完全去除细胞中的微生物污染是非常困难的!因为不管是哪一种操作,对细胞的生长而言都是一种额外刺激,很有可能导致细胞状态改变甚至死亡;而过度使用抗生素可能产生更强抗性的菌株,撤药后极易复发。 所以,对于易于重新获得的细胞株,我们建议直接处理培养物,不分敌我全部消灭,防止感染扩散!对于极为珍贵的细胞样本,我们可以尝试以下处理方法进行挽救。 一、细菌、真菌污染处理方法 1. 用 DBSS 洗细胞(稀释污染物): (a). 对于单层细胞,用 DBSS 浸洗培养物 3 次,胰蛋白酶消化,通过离心重悬用 DBSS 再洗细胞 2 次; (b). 对于悬浮细胞,通过离心重悬用 DBSS 洗培养物 5 次。 2. 在新培养瓶以最低可行种植密度再接种。 3. 加入高浓度抗生素培养基,每 2 天换液。(一般在正常工作浓度的 5-10 倍,建议做梯度实验确保对污染物杀伤力较大,对细胞影响较小) 4. 用高浓度抗生素培养基再培养。 5. 重复步骤 1~4,进行 3 次再培养。 6. 去掉抗生素,在无抗生素培养细胞的状况下再进行 3 次再培养。 7. 通过相差显微镜检查培养物并进行 Hoechst 染色。 8. 在无抗生素的条件下再培养细胞 2 个月,检查确定所有污染已被移除。 细胞培养正常抗生素浓度推荐表
二、支原体污染处理方法 1. 用 D-PBSA 洗涤细胞(稀释可以减少污染物数量): (a). 对于单层细胞,用 D-PBSA 浸洗培养物 3 次,胰蛋白酶消化,通过离心重悬用 D-PBSA 再洗细胞 2 次; (b). 对于悬浮细胞,用 D-PBSA 离心重悬洗涤细胞。 2. 以高种植密度接种 1 个或者多个新培养瓶。 3. 加入高浓度抗生素培养基,每 2 天换液。 4. 用高浓度抗生素培养基再培养,如果不同类型的抗生素与 BM-Cyclin 交替使用,细胞应在应用新抗生素前换液。 5. 去掉抗生素,在无抗生素培养细胞的状况下培养细胞至少 2 周。 6. 用 PCR 或者其他支原体检测方法检测培养物。 7. 在无抗生素的条件下再培养细胞 2 个月,检查确定所有污染已被移除。 支原体去除抗生素浓度推荐表 (数据源于参考文献 3)
上面提到黑胶虫污染主要源于血清,故实验时尽量采用质量和口碑较好的血清培养。 黑胶虫早期污染一般采用如下方法: 1. 用 0.25% 的胰酶消化,当有少量细胞变圆或脱壁时,用血清终止消化; 2. 轻轻用培养液或 D-Hanks 液清洗 3 遍(缓缓流过细胞表面),不要吹打,吹散细胞; 3. 换培养瓶培养,隔天换液,2 天后重复一次; 4. 此后每 24-36 h 换液一次,一周后,黑点基本消失。 上述污染去除方案均是在细胞极其珍贵情况下的无奈之举,在细胞易于获得的情况下还是建议大伙儿直接处理掉污染的细胞,重新以新批次细胞进行试验,不仅节约时间,而且风险更小。
以上就是今天想和大家分享的全部内容,希望对你们有帮助哦 ~
参考文献 1. 陈思瑶,吴亚猛等。细胞培养过程中常见的微生物污染及处理方法 [J]. 吉林医药学院学报,2016. 2. 姜彬。细胞培养技术简介及避免污染的策略 [J]. 生物学通报,2008. 3. R. Lan Freshney 著,章静波,徐存拴,等译。动物细胞培养 —— 基本技术和特殊应用指南(原书第七版). 科学出版社,2020. 4. 周怡婷,高增鸿等,细胞培养中 「黑胶虫」 污染的检测及防治 [J]. 生物化学与生物物理进展,2019. |