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青光眼是第一大不可逆的致盲性眼病,有数据表明我国在 2020 年青光眼患者预计超过 2000 万人。高眼压是青光眼最主要的致病机制,临床药物多通过增加房水流出、抑制房水生成等途径降低眼压,但是都无法作用于青光眼最根本的致病部位——小梁网细胞 (TM 细胞)。不过,ROCK 抑制剂可以通过改变 TM 细胞形态、细胞运动、胞质分裂和平滑肌收缩等影响细胞骨架,从而增加房水流出,降低眼压。 ROCK 蛋白分子结构 ROCKs 是 Rho 相关卷曲螺旋形成蛋白激酶 (Rho-associatedcoiled-coil kinase),简称 Rho 激酶,属于丝氨酸-苏氨酸激酶家族。Ras 同源基因家族成员 A(RhoA) 及 ROCK 介导了许多病理生理信号,包括诱导细胞骨架重组、细胞迁移、黏附、增殖分化、组织收缩和生长等。因此,ROCK 抑制剂在包括哮喘、癌症、勃起功能障碍、青光眼、胰岛素抵抗、肾衰竭、神经元退化和骨质疏松症等疾病中都具有潜在的应用价值 [1-3]。 ROCK 又分 ROCK1 和 ROCK2,是丝氨酸/苏氨酸 AGC 激酶家族的成员。在人类中,它们都位于 18 号染色体上,且具有高度的序列同源性,ROCK1 和 ROCK2 的氨基酸序列同源性达 64%,在其激酶域的同源性高达 92%[2, 3]。
图1:ROCK1/2蛋白结构[2]
ROCK 蛋白主要有三大结构域,N 端的激酶结构域;中间有一个卷线圈域(coiled-coil region),该区域包含一个 Rho 结合域 (Rho-binding domain, RBD) 的螺旋线圈区域,RBD 是结合 RhoGTP 并激活 ROCKs 蛋白的区域。而 ROCK1 有一个额外的同源区域 (homology region, HR) 来结合 RhoA。在 C 末端,有一个普列克同源结构域 (pleckstrin homology domain, PHD),其中有一个富含半胱氨酸的手指状域 (zink finger-like domain, ZFD),在 ROCKs 与膜结合的稳定性中起重要作用(图 1)。此外,ROCKs 蛋白还可以被 C 端的裂解激活,如 Casp3 和 GZMB 可以分别裂解激活 ROCK1 和 ROCK2[2, 3]。 Rho/ROCK 信号途径 以血管生成相关疾病模型为例,在内皮细胞中,膜上被激活的受体通过衔接蛋白招募并激活 GEFs。GEFs 刺激 GDP 与 GTP 的交换,导致 RhoA 的激活。ROCKs 是 RhoA-GTP 的一个效应器。ROCK 下游底物包括 MLC、MLCP 和 LIMK。MLC 和 LIMK的磷酸化参与肌动蛋白解聚和吸解收缩,从而调节内皮细胞粘附、收缩和迁移。此外,ROCK 磷酸化 PI(4)P5K。作为 PI(4)P5K 的主要产物,PI(4,5)P(2) 与肌动蛋白相关蛋白相互作用,刺激肌动蛋白细胞骨架的重组,并触发应力纤维聚合。ROCK 还促进了 Pyk2 对 FAK2 的磷酸化,从而调节局部粘连的组装(图 2 )[3]。
图2:内皮细胞中ROCKs相关信号途径[3]
除此之外,ROCKs 下游底物还包括:Bcl2、PTEN、Akt、Tsc1/2、Rheb、mTorc1、ENDO、VIM、NHE1、GFAP、EF-1α、KIF2a、MAP2、CRMP2 等(图 3 ),从而调节如自噬、细胞生存和凋亡、囊泡动力学、细胞骨架调节、细胞生长和再生,以及细胞形状和运动等不同的细胞反应[2]。
图3:ROCKs底物[2]
ROCK 抑制剂 考虑到 ROCK 的重要作用,目前已经开发出多种 ROCK 抑制剂。几乎所有的 ROCK 抑制剂都是 Ⅰ 型 ATP 竞争激酶抑制剂,这意味着末端磷酸盐从 ATP 转移到各自底物的过程被阻断了。fasudil 是两种 ROCK 亚型的有效抑制剂,Ki 值为 0.33 μM,但是 fasudil 同时也抑制 PKA,PKG,PKC 和 MLCK 等其他激酶。目前 fasudil 还有一些改进的衍生物:如其活性代谢物hydroxyfasudil (CSN17105),其 Ki值 为 0.17 μM,并且抑制的其他激酶相较于 fasudil 只有 PKC 和 MLC ;更进一步改进的有 dimethylfasudil 和 ripasudil(CSN16953)(图 4 )。目前日本已经批准 ripasudil 用于治疗青光眼[2, 3]。
图4:ROCKs抑制剂结构[2]
首次 ROCK 抑制剂由吉美制药开发,Y-27632 (CSN12226) 是一种选择性抑制剂(图 4 ),针对 ROCK1 的 Ki 值为 140 nM,针对 ROCK2 的为 300 nM,比其他激酶如 PKC、MLCK 等的敏感性高近 200 倍。Y-27632 及其衍生物 Y-32885 和 Y-39983 已被证明参与轴突生长和视神经的神经再生[2]。目前还有一些其他种类的抑制剂正在研发中:
表1:ROCK的部分抑制剂(数据来源:药渡) 更多产品信息,请登录 CSNpharm 丁香通商铺查看:
ROCK 抑制剂的主要缺点是其对靶点的特异性不够高。不仅是 ROCKs 与其他激酶之间,由于 ROCK 两个亚型激酶结构域的高度相似性,这两个亚型之间的抑制剂选择性也不够好。因此,研究高特异性ROCK 抑制剂是亟待解决的问题。
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参考文献: 1. 于珊珊, et al., RhoA/ROCK信号通路与肾脏疾病的研究进展.中国临床保健杂志, 2021. 24(02): p. 284-288. 2. Koch,J.C., et al., ROCK inhibition in modelsof neurodegeneration and its potential for clinical translation.Pharmacology & Therapeutics, 2018. 189:p. 1-21. 3. Liu,J., et al., Rho-Associated Coiled-CoilKinase (ROCK) in Molecular Regulation of Angiogenesis. Theranostics, 2018. 8(21): p. 6053-6069. |