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随着研究的不断深入,现代神经科学需要关注大量不同种类的神经元或胶质细胞,如多种 GABA 能中间神经元、小胶质细胞等。遗憾的是,这些细胞往往没有成熟的、不泄露的启动子供选择,那么在这种情况下,我们该如何实现细胞类型特异性的标记或操作呢?答案便是借助 Cre-LoxP 或 Flp-FRT 等重组酶系统。 简单来说,这类重组酶系统是通过特异位点重组酶 (Site-specific recombinases, SSRs) 介导重组酶特异识别位点 (Recombination tar-get sites, RTs) 间的重组,来实现特异位点的基因敲除、基因插入、基因翻转和基因易位等操作。由于该技术能够有效克服其他类型重组技术的非特异性或重组效率低等缺点,近年来已逐渐在功能基因研究领域占据了主导地位。 Cre-loxP 的基本原理 Cre(Cyclization Recombination Enzyme)是一种重组酶,于 1981 年从 P1 噬菌体中被发现,其基因编码区序列全长 1029bp,为 38kDa 大小的、由 343 个氨基酸组成的多肽单体蛋白。Cre 重组酶的 C-末端结构域包含催化活性位点,能够催化 DNA 分子中特定位点之间的重组。 LoxP 是 Locus of X-overP1 的缩写,是位于 P1 噬菌体中长度为 34bp 的一段序列,由两个 13bp 的反向回文序列和 8bp 的中间间隔序列共同组成,反向回文序列是 Cre 重组酶的识别和结合区域,间隔序列决定 LoxP 序列的方向。 Cre 重组酶不仅具有催化活性,而且与限制酶相似,能识别特异的 DNA 序列,即 loxP 位点,使两个 loxP 位点间发生基因重组。Cre 重组酶无需借助任何辅助因子,可作用于多种结构的 DNA 底物,如线形、环状甚至超螺旋 DNA。此外,Cre 重组酶的活性可控,可以使之只在某类特定细胞类型中表达,也可以使之由特定的外部刺激(如化学信号、热刺激)触发表达。在神经科学领域,此技术可以用于对神经环路的特异性标记、特异细胞类型中内源基因的功能研究及构建小鼠模型等。 Cre-loxP 诱导基因重组的几种方式 一般而言,当细胞基因组内存在两个 LoxP 位点时,Cre 重组酶会诱导两个 LoxP 位点间的序列发生重组。首先,Cre 重组酶结合到两个 13bp 的回文序列形成二聚体,然后这个二聚体和另外一个 loxP 位点上的二聚体结合,形成四聚体。LoxP 位点是有方向的,形成四聚体的两个 loxP 位点是平行的,随后这两个 loxP 位点间的双链 DNA 被 Cre 重组酶切掉,然后切口在 DNA 连接酶的作用下重新连接。重组的结果取决于两个 loxP 位点的方向,主要有以下几种可能: ① 如果两个 LoxP 位点位于一条 DNA 链上,且方向相同,Cre 重组酶能有效地删除两个 LoxP 位点间的序列(Deletion)(图 1A); ② 如果两个 LoxP 位点位于一条 DNA 链上,但方向相反,Cre 重组酶能诱导两个 LoxP 位点间的序列翻转(Inversion)(图 1B); ③如果两个 LoxP 位点分别位于两条不同的 DNA 链或染色体上,Cre 重组酶能诱导两条 DNA 链发生交换或染色体易位,即基因转座(Translocation)(图 1C) ④如果四个 loxP 位点分别位于两条不同的 DNA 链或染色体上,Cre 重组酶能诱导 loxP 间的序列互换(cassette exchange)(图 1D)。 图 1 Cre-loxP 诱导基因重组的方式 Cre-LoxP 系统可以实现对基因的操控,根据 Cre 重组系统诱导基因重组的方式,我们可以通过如下两种策略实现 Cre 依赖的基因表达: LSL 序列(条件性基因选择) 将 LoxP2 和转录终止信号盒(Transcription STOP cassette)插入启动子和目的基因之间,转录终止信号盒两端各有一个同向的 LoxP 位点,组成 LoxP-STOP-LoxP-gene 模式,即 LSL 序列。 此情况下,在无 Cre 酶存在的细胞中,转录终止信号盒下游靶基因完全不表达,但如果细胞中含有 Cre 酶,基因重组中的 Deletion 过程发生,移除转录终止信号盒,进而表达目的基因。这是一种简单有效的办法,我们可以通过 LSL 的设置,有选择性地(根据 Cre 品系动物选择)在某些细胞中表达基因。但此法的缺点是可能会发生转录的泄露,即转录时跳过 STOP 序列,在无 Cre 酶的作用下也会表达基因。 图 2 Cre 依赖的基因表达-LSL 策略 DIO/DO 序列 通过引入两对不相容的反向 Lox 位点-LoxP 和 Lox2272,经过两组 Lox 位点的两轮重组可达到一种稳定状态。也就是可以通过 Cre 重组酶的存在与否来控制基因的表达。 这种策略被称为 DIO(Cre-on)或 DO(Cre-off)。在这种策略下,任一对 Lox 位点间的序列会在 Cre 的作用下发生可逆的快速翻转,之后 Cre 重组酶马上不可逆地切割翻转后的同向 Lox 位点,只留下翻转后的基因和单独的 LoxP、Lox2272 位点,防止基因的再次翻转。这种巧妙的设计让科研人员可以在病毒载体中构建 DIO 和反向基因,感染 Cre 阳性细胞后,可以让 Cre 阳性的细胞表达基因,是为 DIO 结构;如果预先包装的基因是正向,那么 Cre 阳性的细胞则不表达基因,其余细胞表达基因,是为 DO 结构。因此,人为操控基因表达变成了现实。 图 3 借助 LoxP 和 Lox2272 的 FLEX 策略实现 Cre 依赖的基因表达 (Scott M. Sternson, et al., J. Neurosci., 2008) Cre-loxp 系统的应用 1、特异性标记 / 环路示踪 可以借助 Cre 品系的小鼠和 Cre 依赖表达的病毒载体结合使用,达到特异性对某些细胞的标记和操控目的。运用神经示踪技术对大脑特定神经环路的结构和功能进行解析时,亦可以借助 Cre 重组酶系统和 AAV 血清型(比如 rAAV2/9、rAAV2/retro、rAAV2/1)结合适用,达到特异性对神经环路标记和功能研究的目的。 图 4 基于 rAAV1-Cre 顺行单级跨突触示踪 (Zheng P’s lab., Sci Adv., 2019) 2、病毒依赖的基因重组 由于转基因动物依赖的基因重组存在耗时长、成本高、区域或者组织特异性不高等不足,现在越来越多的科研工作者开始采用比较灵活的方式使用 Cre-loxP 系统。通过病毒引入 Cre 或 loxP 元件,结合一种转基因小鼠是比较常用的方式(图 3)。相比于转基因动物依赖的基因重组,病毒依赖的基因重组有以下优点: 更强的区域特异性:由于病毒可以通过局部注射的方式保证区域特异性感染,再加上驱动 Cre 基因的特异性启动子,能够实现更强的区域和细胞特异性的基因重组; 更少的花费:购买转基因动物的费用一般是比较昂贵的,而且转基因动物的饲养、基因型鉴定都需要不少的人力、物力,而病毒的制备、保存和注射所花的费用相对来说是比较少的; 更短的实验周期:由于病毒能非常迅速的起作用,而转基因小鼠的交配过程特别耗时间,因此采用注射病毒到转基因小鼠体内的方式,可以大量缩短实验周期。 图 5 LoxP 动物结合表达 Cre 的病毒进行基因敲除 Cre-loxP 系统的优势 在当今世界上,Cre-loxP 系统是在神经系统中应用最广泛的条件性基因敲除工具,主要是因为该系统有如下优点: 1 高效性:Cre 重组酶与具有 loxP 位点的 DNA 片段形成复合物之后,可以提供足够的能力引发之后的 DNA 重组过程,重组过程简约高效; 2 特异性强:loxP 位点是一段含回文序列结构和中间有间隔的 34bp 元件,这种结构保证了 loxP 序列的一致性,从而保证基因重组的特异性很强; 3 可应用范围广:Cre 重组酶是一种比较稳定的蛋白质,可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用,所以说 Cre-loxP 系统的可应用范围非常广; 4 可由二型启动子启动表达:Cre 重组酶的编码基因可由任何一种二型启动子驱动,由此保证 Cre 重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官或者在不同的发育阶段或不同的胜利条件下表达,从而实现较高的组织和细胞特异性。 更多 Cre 系统的病毒载体工具请咨询和元生物 改造的 Cre-loxP 系统 经过现代基因工程方法对 Cre 和 loxP 元件的改造,Cre-loxP 系统实现了更加丰富的条件性重组策略。 1、对 Cre 元件的改造:对 Cre 元件的改造提高了 Cre 重组酶的活性,并且实现了药物可诱导性。例如,通过在 Cre 元件上引入真核细胞核定位序列 NLS,Cre 重组酶能在低表达丰度下实现重组,这对于一些低丰度的启动子很重要。另外,在 Cre 元件的 C 端接上一段改造过的配体结合结构域 LBD,新的融合蛋白 Cre-LBD 将定位在胞浆内,当人工合成的激素分子结合到 Cre-LBD 受体后,蛋白构象改变并进入核内,介导基因重组,目前使用最多的是 tamoxifen 诱导的 CreERT2 突变体,它的 LBD 来自于雌激素受体 ER 分子,当有 tamoxifen 的时候,Cre 才能介导基因重组,这样通过控制 tamoxifen 的注射时间,可以实现对基因重组时间特异性的调控; 图 6 tamoxifen 诱导的 Cre-ER 系统 (Hyeonhui Kim, et al., Lab Anim Res., 2018) 2、对 loxP 元件的改造:loxP 元件也有一些突变体,间隔区和回文序列都可以进行突变,突变后的序列依然能被 Cre 重组酶识别和重组,但是突变的 loxP 序列必须和同样突变的 loxP 序列匹配介导基因重组,而不能和未突变的 loxP 序列匹配,这样将不同的 loxP 序列组合用于控制多个基因(如上文所述的 lox2272 位点),在同一 Cre 重组酶的作用下,可以实现多序列的基因重组,产生非常多元的重组结果。例如彩虹脑(Brainbow)技术绚丽多彩的荧光标记效果正式基于对 loxP 序列的改造实现。 其他重组酶系统 除 Cre-LoxP 系统外,类似的还有与 Cre-LoxP 系统无交叉影响的 vCre-vLoxP、sCre-sLoxP 系统,及 Flp-FRT/F5 系统和 Dre-Rox1/Rox2 系统,对应的表达方案分别为 fDIO 和 dDIO 系统。多套重组酶体系的存在为研究中设计多个限制条件提供了便利,灵活应用 Cre、Flp、Dre 重组酶系统将有助于更深入课题的开展。 1、Flp-FRT 系统 Flp-FRT 系统与 Cre-loxP 类似,也是由一个重组酶和一段特殊的 DNA 序列组成。其中,Flp(flippase recombination enzyme)重组酶,是从酵母细胞内被发现的,其基因全长 1272bp,为 48kDa 大小的、由 423 个氨基酸组成的多肽单体蛋白。 FRT 是 Flp 的识别位点,全长 48bp,由 3 个 13bp 的反向回文序列和 8bp 的间隔序列共同组成。与间隔序列相邻的两个反向回文序列是 Flp 重组酶的识别和结合区域,间隔序列是重组发生的区域,也决定了整个序列的方向。 Flp-FRT 系统与 Cre-loxP 诱导基因重组的方式类似,这两个系统比较明显的区别是这个重组酶(Cre 和 Flp)具有不同的最佳反应温度,有研究发现,Cre 重组酶的最佳温度为 37℃,而 Flp 重组酶为 30℃。后来科学家们,构建了 Flp 突变体--Flpo,其在 37℃也表现出较好的耐热性。 2、Dre-Rox 系统 Dre(D6 site-specific DNA recombinase)也是从噬菌体中发现的一种酪氨酸重组酶,其识别的是 32bp 的 DNA 序列 rox,包含两个 14bp 反向回文序列和 4bp 的中间间隔序列。Dre 重组酶和 Cre 重组酶具有特异性,Dre 重组酶不能识别 loxp 位点,同时 Cre 重组酶也不能识别 rox 位点。 图 7 Cre\Flp\Dre 系统比较(Lief E Fenno, et al., Nat Methods., 2014) 3、vCre-vloxp 和 sCre-sloxp 系统 vCre 和 sCre 均为 Cre 重组酶的同源蛋白,但他们与 Cre 的同源性很低,可以特异性识别 vloxp 和 sloxp。 图 8 借助 vCre-vloxp 系统标记 mPFC-vHPC 的投射 此次和元首届518病毒节惊喜不断,不仅有病毒包装低价秒杀,直播惊喜免费抽奖,消费成单即送好礼,还有病毒载体知识分享,科研知识精彩讲解,现场互动提问答疑等活动。 参考文献 [1] Front Genet. 2016 Feb 19;7:19. doi: 10.3389/fgene.2016.00019. [2] Sci Adv. 2019 Feb 20;5(2):eaat3210. doi: 10.1126/sciadv.aat3210. [3] Nat Methods. 2014 Jul;11(7):763-72. doi: 10.1038/nmeth.2996. [4] J Biol Chem. 2020 Jan 17;295(3):690-700. doi: 10.1074/jbc.RA119.011349. [5] J Neurosci. 2008 Jul 9; 28(28): 7025–7030.doi: 10.1523/JNEUROSCI.1954-08.2008 [6] Lab Anim Res. 2018 Dec;34(4):147-159. doi: 10.5625/lar.2018.34.4.147. [7] Nucleic Acids Res. 2004 Nov 18;32(20):6086-95. doi: 10.1093/nar/gkh941. [8] Dis Model Mech. Sep-Oct 2009;2(9-10):508-15. doi: 10.1242/dmm.003087. [9] Nucleic Acids Res. 2011 Apr;39(8):e49. doi: 10.1093/nar/gkq1280. |