在染料法定量扩增实验中,熔解曲线发挥着关键作用,它可以帮助我们判断反应是否有非特异扩增。那么熔解曲线的基本原理是什么呢?
首先我们需要了解染料法荧光标记的作用原理。SYBR Green I 是应用最广泛的染料法荧光标记,可以广泛地结合到 DNA 双链的小沟中,从而发出比游离状态下强 1000 倍的荧光。因此,在 PCR 的延伸期,随着双链产物的不断增加,嵌入到双链中的荧光分子也不断增多,荧光信号的变化可以反映产物量的变化。
那么熔解曲线是如何产生的呢?在扩增结束后,荧光信号强度达到一个最高值,之后我们设置一段由 65℃逐渐升温到 95℃的程序,随着温度逐渐升高,DNA 双链逐渐解链为单链,从以上的原理我们知道,嵌入到双链中的荧光染料分子也会逐渐脱落下来,所以荧光信号强度逐渐下降。在某段温度时,双链迅速而大量地解链,荧光信号强度骤然下降,这段温度中,一半的双链解链的温度我们称为熔解温度(即 Tm 值)。最终,DNA 双链完全解链为单链,荧光值下降为一个本底水平,这一过程中的荧光信号随温度变化的曲线就是熔解曲线,称为原始图谱。该图谱做负导数换算后得到熔解曲线的导数图谱,导数图谱会出现熔解峰,熔解峰对应的温度就是 Tm 值。 不同的产物按照其 GC 含量,片段大小,盐离子浓度的不同,其对应的 Tm 值也是不同的。 熔解曲线为一个单一的尖锐峰,说明无非特异性荧光产生,此时定量准确。
熔解曲线出现杂峰,说明产生了非特异产物,荧光值不能反映目的产物量的值,此时定量不准确。至此,我们也就知道熔解曲线是双峰,Ct 值不能用来做进一步计算。
如果扩增出现非特异性荧光,可能的原因及排除方法有:
1. 引物设计不合理,存在非特异扩增或引物二聚体 ——提高模板的加入量 ——降低引物的加入量 ——稍微提升退火温度 ——重新设计合适的定量引物得到特异扩增产物
2. 体系存在杂质或者污染 ——提取 RNA 之后进行 RNA 纯度和完整性鉴定,避免使用不纯的模板 ——操作过程在超净台中进行,避免引入环境污染 ——注意试剂的取用和保存,避免交叉污染
3. 试剂抗逆性较差 ——选用高效的荧光定量试剂消除非特异性扩增 ——优化反应条件和反应体系
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