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量化揭秘微波条件下的多肽合成:
---------- 微波作用下的多肽固相缩合反应及动力学研究 杨明,王卫国,李佩华,张俊,沈树宝。微波作用下的多肽固相缩合反应及动力学研究 [J]. 有机化学 , 2008, 28(05): 851-856. 摘 要 分别在微波作用以及传统加热两种方式下,研究了 Fmoc-Val-OH 与 NH2-Tyr-(tBu)-Wang 树脂的固相缩合反应及其动力学。测定了温度变化对反应速率的影响,并获得了 Fmoc-Val-OH 与 NH2-Tyr-(tBu)-Wang 树脂在两种方式下的宏观动力学参数:300W 微波作用下表观缩合反应级数为 2.3,活化能为 104.7kJ/mol;传统方法中表观反应级数为 2.9,活化能为 142.4kJ/mol。微波作用将常规条件下的产率由 68% 提高到 95%,而所需时间仅降为常规条件的 1/14。 关键词 微波合成;多肽固相合成;缩合反应;反应动力学 自微波技术在多肽合成领域首次应用 [1] 以来,出现了能够实时控制反应温度、压力的专业微波多肽合成系统,人们开始了多肽固相合成的新历程 [2~7]。在多肽固相合成动力学方面, Yan [6] 等人研究了传统方法下肽 - 树脂切割的反应动力学, Li 等人 [7] 则绘制了微波作用下羧基组分上载的动力学曲线,但是微波强化多肽缩合反应动力学研究国内外尚无报道。多肽缩合反应是肽链延伸的反应,每步缩合反应的效率与速率都直接影响着目标肽的生产效率与速率,因此对微波作用下的缩合反应的研究显得尤为重要,这项研究对微波作用下缩合反应结果的预测、反应条件的选择、最终多肽产率与效率的提高均具有指导意义。本文以 Fmoc-Val-OH 与 NH2-Tyr (tBu)-Wang 树脂的缩合反应为研究对象,研究了微波作用下多肽固相缩合反应过程的表观动力学,得到了缩合反应的动力学曲线并计算出了表观动力学参数。同时将微波作用下的缩合反应与常规条件下的反应进行了比较,并尝试解释了微波对固相多肽缩合反应的作用。 1 实验部分 1.1 实验仪器和材料 MARS 5 微波反应系统(美国 CEM 公司);紫外检测器 UVD170U(美国戴安公司);BP110S 型电子天平(德国 Sartorias 有限公司);RQ-400DB 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);MicroModulyo-230 冻干机(美国 Thermo 公司)。 Wang 树脂购自天津南开和成科技有限公司,取代度为 1.1mmol/g;Fmoc 氨基酸 [Fmoc-Tyr (tBu)-OH、 Fmoc-Val-OH] 和缩合试剂 [1 - 羟基苯并三唑(HOBT)、苯并三氮唑 - N,N,N',N'- 四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、N,N - 二异丙基碳二亚胺(DIC)、六甲基磷酰三胺(HMPA)、DIEA] 均购自吉尔生化(上海)有限公司,纯度均高于 98%;(DMF)、二氯甲烷 (DCM)、甲醇、乙醇均为市售分析纯。 1.2 实验方法 1.2.1 Fmoc-Tyr-(tBu)-Wang 树脂的制备以及未反应羟基的封闭 按照文献 [8] 所提供的方法制备 10g Fmoc-Tyr-(tBu)-Wang 树脂。 未反应羟基的封闭:将 6ml 无水吡啶、6 ml yisuan 酸酐溶于 40 ml DMF,溶解完毕倒入树脂中,反应 2 小时,进行封闭。反应完后用 DMF、DCM、甲醇各 4ml 轮流洗涤树脂三次,每次 1min ,真空干燥,树脂用芴烯 - 哌啶法 [9] 确定上载率以及羟值。 1.2.2. Fmoc-Tyr-(tBu)-Wang 树脂上 Fmoc 保护基的脱除 称取 0.1g Fmoc-Tyr-(tBu)-Wang 树脂(含 - NH2 0.078mmol),加入 1ml 20% 哌啶 / DMF(v/v)反应 10min,抽滤,再加入 1ml 20% 哌啶 / DMF(v/v)反应 10min,除去滤液,并用 DMF、DCM、甲醇各 4ml 轮流洗涤树脂两次。 1.2.3 Fmoc-Val-OH 与 NH2-Tyr-(tBu)-Wang 树脂缩合反应动力学实验方法 将 0.214 mmol Fmoc-Val-OH、0.428 mmol DIEA、0.214 mmol HOBT、0.214 mmol HBTU 溶于 2ml DMF 反应,得到活化氨基酸溶液。将活化液预热完毕加入装有 0.078mmol NH2-Tyr-(tBu)-Wang 树脂的反应器中,置于 MARS5 微波反应系统中反应,微波功率为 300W,反应时间与动力学曲线一致。反应完毕后,树脂立即用 6ml 无水甲醇、6ml DCM、6ml DMF 交替洗涤三次。 在洗涤完毕的树脂中加入 2ml 20% 哌啶 / DMF(v/v)脱保护 20min,抽滤,并加入无水乙醇洗涤树脂,滤液与洗液使用无水乙醇定容至 50ml;取 1ml 定容完毕的溶液,稀释 10 倍,以无水乙醇作为空白,测量在 301nm 处的紫外吸收值。 1.3 分析方法 实验结果采用紫外分光光度法进行分析,Fmoc-Val-Tyr-(tBu)-Wang 树脂 20% 哌啶 / DMF(v/v)反应生成的芴烯 - 哌啶复合物在 301nm 处有最大吸收 [8]。紫外吸收值与 Fmoc 的关系符合方程 y=0.0728x+0.0034 (标准曲线为自制,相关系数 R2=0.99954,x 为 Fmoc 的浓度,单位为 10-5mol/L;y 为紫外吸收值)。 2.1 数据处理 2.1.1 反应级数 α 的确定 -dCA/dt=k*CAαCBβ 反应过程中活化氨基酸过量,可以近似认为 CBβ 为定值,令 k’=kCBβ, 有:ln (-dCA/dt)=lnk’+αlnCA ; 作 ln (-dCA/dt)-lnCA 图像,即可求出反应级数 α。 2.1.2 反应活化能 Ea 的确定 作 lnk’-(-1/RT) 图像,即可求出反应的活化能 Ea。 2.2 微波强化多肽固相缩合反应的相关曲线及参数 微波作用下 Fmoc-Val-OH 与 NH2-Tyr-(tBu)-Wang 树脂的固相缩合反应具有较高的产率和速率,如图 1 所示,各温度下的缩合反应在 5min 之内收率均超过 95%。 根据 300W 微波作用下的 CA-t 曲线,算出不同温度时不同浓度下的 - dCA/dt 值,作 ln (-dCA/dt)-lnCA 图,得图 2。300W 微波作用下缩合反应的参数参见表 1,结果表明在 300W 微波作用下 Fmoc-Val-OH 与 NH2-Tyr-(tBu)-Wang 树脂缩合反应的反应级数为 2.3。
表1 微波作用不同温度下的 lnk’以及反应级数 α
Table 1 lnk’ and reaction stage α at different temperatures under microwave irradiation
作 lnk’-(-1/RT) 图,得图 3,拟合方程得 lnk’=45.248-104726/RT,微波作用下 Fmoc-Val-OH 与 NH2-Tyr-(tBu)-Wang 树脂缩合反应的活化能为 104.7kJ/mol。 2.3 传统方法中多肽固相缩合反应的相关曲线及参数 图 4 描述了传统加热方法下 Fmoc-Val-OH 与 NH2-Tyr-(tBu)-Wang 树脂的固相缩合反应的产率 - 时间关系,结果表明:缩合反应达到平衡需要 70min,最终产率可以达到 68%,反应的产率与速率均低于微波作用下的缩合反应。 表 2 传统方法不同温度下的 lnk’以及反应级数 α Table 2 lnk’ and reaction stage α at different temperatures under conventional heating
2.4 微波作用与传统方法下的多肽缩合反应的比较及分析
表3 微波作用与传统加热条件下反应参数的比较
Table 3 Comparison of parameters under microwave irradition and conventional heating
实验结果表明:传统加热方式下的多肽缩合反应在超过 70min 时最终产率不超过 70%,而在微波作用下的缩合反应在不到 5min 的时间里,产率就可以达到 95%,反应的速率与效率均有了很大的提高。另外与传统方法相比,微波作用下缩合反应的表观活化能以及反应级数都有所降低。 微波作用下 Fmoc-Val-OH 与 NH2-Tyr-(tBu)-Wang 树脂的固相缩合反应速率高于传统方法是因为: 一方面,微波作用下极性分子的运动速度加快,造成单位时间里的碰撞次数增多,同时由于反应活化能的降低,有效碰撞的几率变大,二者共同引起单位时间内的有效碰撞次数增多,从而加速了反应; 另一方面,微波作用下,极性分子带动非极性分子运动,树脂溶胀速度加快,反应时传质速度加快,也加速了反应。 缩合反应收率的提高得益于微波的多重效应: a. 极性溶剂分子运动速度加快,极性分子带动非极性分子运动,使得一些深藏于树脂内部的 - NH2 裸露参与反应,有利于提高反应的收率; b. 微波作用加速了溶剂分子和树脂上极性基团的运动,导致树脂表面与溶液间的扩散层变薄,如图 7 所示,使得 CB<CB ’ ,在树脂表面形成局部类似均相的反应环境,提高了树脂表面的活化氨基酸的浓度,从而提高了反应的收率。 3.结论 1)微波作用下多肽缩合反应与传统方法相比,具有较高的产率和收率,以 Fmoc-Val-OH 与 NH2-Tyr-(tBu)-Wang 树脂缩合反应为例,微波作用下的收率比常规方法提高了 35%,而反应时间却缩短为传统方法的 1/14。 2)Fmoc-Val-OH 与 NH2-Tyr-(tBu)-Wang 树脂缩合反应微波作用下的表观反应级数为 2.3,表观活化能为 104.7 kJ/mol;而传统方法下表观反应级数为 2.9,活化能为 142.4kJ/mol。 4.参考文献 [1] Yu,H.-M.;Chen,S.-T.;Wang,K.-T. J. Org. Chem. 1992,57,4781. [2] Murray,J.-K.;Gellman,S.- H. J. Comb. Chem. 2006,8,58. [3] Wang,W.-G.;Li,P.-H.;Shen,S.-B.;Ying,H.-J.;Ouyang,P.-K. Chin. J. Org. Chem. 2006,26,826 (in Chinese). (王卫国,李佩华,沈树宝,应汉杰,欧阳平凯,有机化学,2006, 26,826.) [4] Zhu,X.-W.;Liao,L.-W.;Cui Y.-D.;Fang,Y.-X. Fine Chem . 2001,18,295 (in Chinese). (朱学文,廖列文,崔英德,方岩雄,精细化工, 2001,18,295.) [5] Shen,S.-B.;Wang, W.-G.;Li,P.-H.;Ying,H.-J;Ouyang,P.-K. CN 1699404,2005,Appl . No. ZL200510040036. 3 (in Chinese). (沈树宝,王卫国,李佩华,应汉杰,欧阳平凯,中国专利,1699404,2005, 申请号,ZL 200510040036. 3. ) [6 ] Yan,B.;Nguyen,N.; Liu,L.;Holland,G.;Raju,B. J. Comb. Chem. 2000,2,66. [7] Wen,B.-L.;Xiao,X.-Y.;Czarik. A.-W. J. Comb .Chem.,1999,1,127. [8] Wang, W.-G.;Li,P.-H.;Song,M.-M.;Shen,S.-B.;Ying,H.-J.; Ouyang,P.-K. Ion Exch. Adsorptio. 2006,22,216 (in Chinese). (王卫国, 李佩华, 宋明媚, 沈树宝, 应汉杰, 欧阳平凯,离子交换与吸附,2006, 22,216) [9] Chen,X.-M.;Chen,H.-R. Zhongshan Univ. (Nat. Sci. Ed),2005,44,61 (in Chinese). (陈向明, 陈河如,中山大学学报(自然科学版),2005,44,61.)
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