山东大学副校长、齐鲁医学部部长陈子江院士团队长期从事生殖医学、生殖内分泌及生殖遗传学的临床和相关基础研究。今年,该研究团队应用 Arraystar lncRNA 芯片在早发性卵巢功能不全病人的颗粒细胞中筛选到一个表达下调的 lncRNA HCP5,该 lncRNA 分子通过抑制 DNA 损伤修复影响卵巢颗粒细胞凋亡。深入机制研究发现,lncRNA HCP5 可以稳定蛋白 YB1 和 ILF2 的互作从而促进 YB1 入核。沉默 lncRNA HCP5 影响 YB1 的核定位及 YB1 与 MSH5 基因启动子的结合,进而降低 MSH5 表达。因此,lncRNA HCP5 通过与 YB1 互作调控 MSH5 转录及 MSH5 介导的 DNA 损伤修复,影响颗粒细胞功能,为早发性卵巢功能不全的疾病发生提供了新的表观遗传调控机制。该研究成果发表在 Nucleic Acids Research(IF:11.147) 上。(芯片实验由康成生物丨数谱生物提供技术服务)
研究背景
早发性卵巢功能不全(POI)的定义是 40 岁前出现闭经,主要表现为月经不调、促卵泡生成激素升高 (FSH>25IU/I) 及雌激素缺乏。早发性卵巢功能不全是最常见的生殖内分泌紊乱,影响了约 1-2% 的育龄妇女。该病在临床上包括三个阶段:隐匿期、生化异常期和显性异常期。生化异常期病人(bPOI)有正常的月经,但 FSH 升高,生育能力下降。临床上 POI 病因复杂,涉及遗传、自身免疫、代谢和感染性因素,发病机制有待进一步阐明。在所有病例中,遗传缺陷导致疾病的约占 20-25%,包括染色体缺陷和基因突变。POI 相关基因的编码区域变异导致的蛋白功能失常目前已被广泛研究。 然而,蛋白编码基因区域仅占人类基因组的 1.5%,研究者开始探索其他非编码 RNA(例如 miRNA、lncRNA、circRNA)的作用。
LncRNA 是一类长度大于 200nt,物种间保守性低的非编码 RNA,通过改变染色质修饰、转录、mRNA 降解、蛋白亚细胞定位调控蛋白编码基因表达,影响神经、内分泌、心血管系统的正常生理功能和疾病发生。
卵泡形成是一个复杂的过程,卵母细胞和体细胞的交流在卵泡发育过程中起着至关重要的作用。颗粒细胞(GCs)作为一种卵巢体细胞,为卵母细胞的发育和成熟提供必需的营养、生长因子和激素。颗粒细胞功能障碍会引起卵泡闭锁和细胞凋亡,并最终导致卵母细胞的丢失。目前,lncRNA 在 POI 过程的作用未知,探索 lncRNA 在颗粒细胞中的作用有助于全面了解 POI 的发病机理。
本研究应用 Arraystar lncRNA 芯片在 bPOI 病人的颗粒细胞中筛选到一个表达下调的 lncRNA HCP5,为 POI 相关基因 MSH5 的临近基因。功能实验表明 HCP5 招募 YB1 调控 MSH5 表达,影响颗粒细胞 DNA 损伤修复。lncRNA HCP5 作为 MSH5 的转录调控因子,为 POI 提供了新的表观调控机制。
技术路线
研究思路
LncRNA 高通量筛选及 PCR 验证
为了探究 POI 过程中 lncRNA 的异常表达,作者利用 Arraystar lncRNA 芯片检测了 10 个 bPOI 病人 vs.10 个同龄正常对照的卵巢颗粒细胞 GCs 中 lncRNA 表达变化,通过 P<0.0005 及 FC>1.75 筛选到 159 个差异表达 lncRNA(Fig1A/B)。进一步通过与 POI 相关基因具有共定位或共表达关系缩小范围,锁定 POI 相关基因 MSH5 上游 276kb 处的差异下调 lncRNA HCP5 并在 20 bPOI vs. 22 control 进行了扩大样本验证(Fig1C/D),HCP5 已知与人类自身免疫疾病、感染、癌症相关,CPC2 及 CPAT 分析确认 HCP5 为非编码 RNA。FISH 及分离核质 RNA 实验证明 HCP5 定位于细胞核。 图 1. Arraystar Human lncRNA 芯片筛选结果、HCP5 染色体位置及 qPCR 验证 A&B. 十对 bPOI 病人和同龄正常对照卵巢颗粒细胞 GCs 芯片筛选的差异表达 lncRNA 聚类图和火山图。 C.lncRNA HCP5 在基因组上位于 chr6 POI 相关基因 MSH5 上游 276kb 处。 D.RT-qPCR 扩大样本 (20 bPOI vs. 22 control) 验证 lncRNA HCP5 在 bPOI 病人颗粒细胞中表达下调
功能研究
有研究表明,lncRNA 可以 cis 调控临近基因表达,因此作者推测 lncRNA HCP5 可能 cis 调控 MSH5 表达。卵巢颗粒细胞系 KGN 中利用 shRNA 敲除 HCP5,qPCR/WB 检测 MSH5 的 mRNA 及蛋白表达下调(Fig2A/B),且两者 RNA 具有共表达相关性。已知 MSH5 参与 DNA 双链断裂(DSBs)的同源重组修复,作者检测了卵巢颗粒细胞系 KGN、COV434 和 SVOG,通过 ETO 促进 DSBs 后敲除 HCP5,DNA 双链断裂的标志物 γH2AX 增加,因此 HCP5 抑制 DSBs(Fig2C);KGN 细胞系中通过 CPT 促进 DNA 断裂(只能被同源重组修复)后敲除 HCP5,可以延长 γH2AX 出现至消失的时间从而延缓 DSBs 同源重组修复。敲除 HCP5 也可以促进卵巢颗粒细胞凋亡(Fig2D)。 图 2. 敲除 HCP5 影响 MSH5 介导的 DNA 断裂同源重组修复并促进卵巢颗粒细胞凋亡 A. 通过 qPCR 验证敲除 lncRNA HCP5 抑制 MSH5 的 mRNA 表达。 B. 通过 WB 验证敲除 lncRNA HCP5 抑制 MSH5 的蛋白表达。 C. 敲除 lncRNA HCP5 促进 ETO 诱导的 DNA 双链断裂。 D. 敲除 lncRNA HCP5 促进卵巢颗粒细胞凋亡。
机制研究
为了探究 lncRNA HCP5 结合的蛋白,作者利用 RNA pull down 富集 HCP5 结合的蛋白进行质谱检测,发现 HCP5 可以结合 YB1,利用 YB1 的抗体做 RIP 实验反向验证,可以富集到 lncRNA HCP5(Fig3A/B)。qPCR/WB/ 免疫荧光实验证明,敲除 HCP5 不会改变 YB1 表达量,但会抑制 YB1 入核(Fig3D)。已知 ILF2 可以结合 YB1 调控其核定位,RIP/Co-IP/IB 实验证明 ILF2 结合 HCP5,敲除 HCP5 影响 YB1 与 ILF2 互作,推测 HCP5 可作为 YB1 与 ILF2 的支架分子(Fig3C)。由于 YB1 可在细胞核内结合启动子影响基因转录,作者进一步探究 HCP5 敲除是否影响 YB1 与临近基因 MSH5 启动子的结合。ChIP-qPCR 证明 YB1 结合 MSH5 启动子,敲除 HCP5 抑制 YB1 与 MSH5 启动子结合(Fig4E)进而抑制 MSH5 的转录(Fig2A/B)。
图 3. lncRNA HCP5 作为分子支架稳定 YB1 与 ILF2 互作,影响 YB1 核定位及 MSH5 转录 A. RNA pull down 实验证明 lncRNA HCP5 结合蛋白 YB1。 B. YB1 RIP 实验反向证明 YB1 结合 lncRNA HCP5。 C. IB 实验证明敲除 lncRNA HCP5 影响 YB1 与 ILF2 的结合。 D. 免疫荧光实验证明敲除 lncRNA HCP5 影响 YB1 的核定位。 E. ChIP 实验证明 HCP5 影响 YB1 与临近基因 MSH5 promoter 的结合。
总结全文,研究结果表明,lncRNA HCP5 在早发性卵巢功能不全病人的颗粒细胞中表达下调,lncRNA HCP5 可以作为支架分子,稳定蛋白 YB1 和 ILF2 的互作从而促进 YB1 核定位,YB1 入核后结合 MSH5 基因启动子促进 MSH5 转录,进而影响 DNA 双链断裂同源重组修复和卵巢颗粒细胞凋亡,为早发性卵巢功能不全的疾病发生提供了新的表观遗传调控机制。
图 4. 早发性卵巢功能不全中 HCP5 降低,抑制 YB1 入核及 MSH5 转录,促进颗粒细胞凋亡
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