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CRISPR/Cas9系统广泛应用于多种细胞系基因敲除株的构建:其中最大的需求就是细胞系基因敲除,如何快速高效构建自己的敲除细胞株是很多人关心的问题。但是,实验时我们往往发现,很难获得细胞敲除纯合克隆,预期的基因敲除经常伴随着很多问题,导致克隆的阳性率往往徘徊在1%以下。 Cas9X | 海星生物带你一起了解一下具体的技术流程: 一、细胞系基因敲除的细胞选择 1、细胞先考虑肿瘤细胞,或者是有文献报道的细胞系;成功有保证! 2、细胞系的培养基便宜,血清要求不高的优先考虑; 3、细胞能够形成克隆,细胞增殖快速的细胞系优先考虑; 4、细胞染色体稳定,细胞不易分化的优先考虑; 5、慎重选择悬浮细胞效率比较低; 二、细胞系敲除的基因要慎重选择 1、原癌基因敲除后,细胞增殖会有问题,所以要考虑基因敲除对细胞株增殖的影响; 2、抑癌基因敲除没有任何影响; 3、细胞信号通路的有时候会导向细胞增殖停止,所以要考虑做单克隆敲除; 4、细胞基因敲除一般选择片段敲除,慎重考虑移码,会影响后续的cDNA基因回补实验; 三、细胞系基因敲除之后的鉴定分析流程 1、做PCR检测目的基因,看看有没有完全敲除; 2、PCR产物要做测序,看看序列的实际情况; 3、mRNA检测,看看是否有敲除效果; 4、WB检测,看看蛋白的情况如何; 5、生物学表型检测; 最后就是做拯救实验,就是将敲除的基因回补到细胞基因组!就完成了一个完整的细胞系敲除研究的所有步骤了。 |