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课堂 | 荧光成像新维度——超快速荧光寿命成像
2019-11-18 11:07
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 荧光寿命是荧光基团在通过发射荧光光子返回基态之前在其激发态下保持平均多长时间的量度。不同荧光基团激发态停时间不同，大多数生物荧光素的荧光寿命时间在 0.2－20 ns。 荧光寿命检测经典方法为点对点的时间相关单光子计数（TCSPC），但由于过去检测硬件的局限和复杂的使用而没有被广泛地应用于科学研究。 随着技术的发展，在显微镜视野内进行超快速全像素荧光寿命信号采集的荧光寿命成像成为可能。 荧光寿命成像 VS 荧光强度成像 荧光寿命成像具有不同于荧光强度成像的众多优点： ● 不受染料浓度的影响 无论染色或免疫荧光的效率高或低，荧光寿命都能呈现一致的数据，这意味着更少的实验数量和重复性更好的实验结果。 ● 不受光漂白的影响 荧光发射时间不受激发光强度的影响，因此不存在光漂白问题。 ● 不受样本厚度和光源噪声的影响  荧光成像新维度 作为荧光成像中除光谱和强度之外的新维度，当前，荧光寿命成像主要应用领域包括： ▌用于样品分离，如利用不同染料荧光寿命的差异将不同组织、正常与癌变细胞等有效分离。  △ 银莓花萼的荧光寿命对比。荧光强度（视频左窗口）无法区分的结构在 Fast-FLIM 和寿命拟合图像（视频左、右窗口）中得以清晰明显的区分。视频后半部分显示为寿命分离的三种成分（RGB）  △ 细胞骨架结构。绿色：Alexa Fluor 555- Vimentin，蓝色：Alexa Fluor 546- tubulin。 荧光团在光谱上非常相似（max 580 vs 573）无法分离，但它们在荧光寿命上差异明显。原图像：512 x 512 像素 ▌揭示分子间相互作用，如利用 FLIM-FRET 研究蛋白-蛋白间相互作用。  △ 表达 EPAC mT2-dVenus FRET 探针的 HeLa 细胞中 cAMP 波动。EPAC 对 cAMP 促进剂 IBMX 和 Forskolin 的响应。成像条件：2 FPS，512 x 512 像素。彩色荧光寿命标尺：ns 鸣谢：Kees Jalink, Bram van den Broek, NKI Amsterdam ▌作为生物传感器，如评价药物/理化条件对细胞的影响、Ca+ 震荡等。  △ 非生理条件（Ph 8.5）哺乳动物细胞自发荧光随 NAD/NADH 的变化：表现为随时间推移荧光寿命缩短、氧化应激不断增强。512 x 512 像素。彩色荧光寿命标尺：ns FLIM 共聚焦显微镜：SP8 FALCON ———— 荧光寿命成像完整解决方案 SP8 FALCON 是徕卡最新的 FLIM 共聚焦显微镜，是市场上第一款真正意义上的荧光寿命成像完整解决方案。其 FLIM 成像速度是经典 TCSPC 检测系统的 10 倍，具有 3D-FLIM、Time-lapse FLIM、大样品 FLIM 图像拼接等众多采图模式。此外，SP8 FALCON 还可以与 DIVE 多光子成像、STED 纳米分辨率成像技术结合，充分拓展了寿光命成像的使用范围，实现可相互验证的多维度样品成像。 对活体样品的超快速荧光寿命成像和寿命对比，实现真正的生物动力学分析和功能成像！  图片来源：徕卡 |
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