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教你用20多种方法来交叉验证你的实验结果,必看必收藏!
2019-09-24 11:04   点击次数: 关键词:
如何用20多种方法来交叉验证你的实验结果?这和验证抗体如出一辙,看完这篇软文,你的科研思路也会被开拓。CST自1999年成立以来,一直以提供最高质量抗体为使命,进行严格的多种方法交叉验证,最终帮助用户以最少的时间、样本和试剂获得可靠可信和可重复的结果,同时,为了帮助科研者顺利地完成投稿,CST还会提供抗体的验证数据
 

CST抗体验证原则:

1.确保抗体特异性

2.确保抗体灵敏度

3.确保批次间一致性

4.提供优化后的稀释比例、实验步骤、配套试剂等


I. 确保抗体特异性

1.用细胞或组织的阳性和阴性对照检测抗体是否特异

◎注:已知HT-29细胞有EpCAM的表达,而Hela细胞没有,验证结果一致者,进行其他测试,不一致者弃之。


2.抗体检测到的靶点是否具有正确的亚细胞定位

◎注:AIF通常定位于线粒体的间隙,应答凋亡刺激而释放;EEA1是一个早期内涵体标志物,也是Rab5效应蛋白,对内涵体膜融合和转运至关重要;在分泌蛋白合成过程中,PDI转位到内质网(ER)中进行翻译后修饰和正确折叠;Syntaxin6是一个广泛表达的SNARE蛋白S25C家族成员, Syntaxin6蛋白定位于反面高尔基体和内体内,通过参与多种SNARE蛋白活动调节膜转运; 紧密连接或闭锁小带ZO-3是周围衔接蛋白,此蛋白连接接合性跨膜蛋白(比如occludin 和claudin)到肌动蛋白细胞骨架; 细胞骨架由三种类型的细胞质基质纤维组成:微管、微丝(肌动蛋白纤维)和中间纤维。球形微管蛋白亚基包含微管建筑块,由α/β-tubulin异源二聚体形成所有真核细胞的tubulin亚单位。


3.抗体检测到的靶点是否在组织特异性表达

◎注:piwi 基因被鉴定是生殖系干细胞自我更新所必须的,Miwi和Mili蛋白都是小鼠Piwi 同源物,在睾丸组织中特异性表达;神经胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和钙结合蛋白(Calbindin)在小脑组织特异性表达。

◎注:抗体的性能在相关小鼠癌症模型上进行评估,Phospho-Akt(Ser473) (D9E)XP® Rabbit mAb#4060在小鼠前列腺癌中高表达,在正常组织中不表达。


4.使用特异性配体、抑制剂处理细胞或调控细胞生长环境,检测待测抗体
  • 翻译后修饰调控

  • 高表达或低表达

  • 亚细胞易位


◎注:EGF是EGFR的配体(Ligand)。A549细胞中,EGF处理后,EGFR会发生易位。YAP在低融合度和高融合度MCF10A细胞中的表达分布差异。


◎注:用适当的激酶激活剂和/或抑制剂处理后细胞样品,检验待测抗体。


5.用磷酸酶处理后的样本,检测待测磷酸化抗体

◎注:磷酸酶处理后,可区分抗体是否能与磷酸化蛋白特异性结合。用磷酸酶处理肺癌细胞后,cdc25C(Ser216)的磷酸化消失。


6.用适当的激酶激活剂和/或抑制剂处理后细胞样品,检验待测抗体

◎注:我们会对待测抗体进行不同应用的检测。


7.siRNA,CRISPR, 或 knockout 细胞或组织,检测待测抗体

◎注:A.SiRNA干扰,WB分析检测Beclin-1(D40C5) XP® Rabbit mAb #3495蛋白变化。B.采用crisper-cas9对细胞进行基因敲除,验证抗体对靶标蛋白的特异性,该产品因有非特异性条带,不达标而被淘汰;C.在支气管内皮细胞特异性敲除RBPSUH蛋白,用待测抗体检测变化。


8.检测siRNA干扰后、本底表达和过表达水平的样本中靶蛋白变化

◎注:siRNA干扰、本底表达和过表达靶蛋白的细胞中,染色检测变化。


9. 用抗原封闭肽阻断抗体后再检测样本

◎注:只有特异性抗体才能被抗原封闭肽彻底中和阻断检测信号,由此确定抗体特异性。


10.多肽芯片分析确保组蛋白抗体的特异性

◎注:CST多肽芯片可在单次实验中检测抗体与所有组蛋白中已知修饰的交叉反应,同时评估临近修饰对抗体检测单个修饰位点的影响。经过以上多肽芯片检测,进一步评估了抗体与组蛋白的所有已知位点和邻近位点修饰是否有交叉反应,从而保证了抗体识别单一修饰位点的特异性。


11.免疫共沉淀分析蛋白之间相互作用

◎注:通过免疫共沉淀,用蛋白与蛋白之间相互作用进一步检测待测抗体。


12.与其他公司的抗体进行性能比较

◎注:与其他品牌产品进行对比分析。

  

II. 确保抗体灵敏度

1.滴定法测定抗体的最佳浓度

◎注:经反复验证,Phospho-Akt (Ser473)Rabbit mAb #4058在箭头所示浓度达到最大检测信噪比。CST以此作为推荐抗体最佳稀释比例的依据。


2. 在高、中和低表达组织或细胞中检测
略……


3.同型对照:比较待测抗体与同型对照,确保可接受的信噪比

◎注:Rabbit (DA1E)mAb IgG XP® Isotype Control #3900: 流式分析SH-SY5Y细胞,使用CREB (D76D11)Rabbit mAbAntibody #4820(蓝色),与同型对照抗体#3900(红色)进行比较。



III.  批次间测试:新批号与老批号进行平行比较,确保批次间的一致性


1.新老批次间各种应用的检测,确保后一批次的质量优于前一批次,或者至少要与前一批次相当,否则不予上市

略……

2.不同批次抗体,稀释相同的倍数,需检测到相同的信号强度

◎注:免疫印迹分析Hela细胞,未经过IFN-α处理或经过IFN-α处理,比较Phospho-Stat3(Tyr705)(D3A7) XP® Rabbit mAb #9145 的 Lot1,Lot2,Lot3和Lot8。注意:批次间的信号保持高度一致。(推荐的免疫印迹稀释浓度从Lot3开始,改为了1:2000) Lot1:2006年1月;Lot 2:2007年6月;Lot 3:2008年10月;Lot 8:2009年4月

 

IV.  提供优化后的稀释比例、实验步骤、配套试剂等

1.经测试优化后的稀释条件和缓冲液



2.经测试过的阳性和阴性对照细胞裂解液样品



3.经优化过的详细操作步骤


意想不到,想成为CST家的一支抗体也这么难,足足经历了20道验证关卡还不止!

CST对待抗体质量的态度收获了无数的抗体粉丝,在第三方机构进行调研时,被全球的科学家认可。连续两届被评为 LSIA 之Best Antibodies*(业界唯一一家获此殊荣的公司),连续三届获CiteAb之 Researchers' Choice*(业界唯一一家收获研究人员如此信任的公司),获评Biocompare 5个(抗体特异性、灵敏度、重复性、技术支持、网站有用性)第一*。CST科学家也在Cell、Nature等杂志发表了200多篇文章,正是生产这些抗体的CST科学家为客户提供技术支持,帮助他们设计实验,解决问题以获得可靠可信的结果!

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关于CST

Cell Signaling Technology (CST) 是由一批研究科学家创立的家族式私营企业,致力于提供世界上高质量的、创新的研究和诊断产品,以加速科学家对生物学的理解,并推动个性化医疗。其高质量的产品和专业的研发精神已被全球客户认可,被公认为细胞信号研究的金标准,被票选为最佳抗体*、研究者的选择*、PTM(蛋白翻译后修饰)年度抗体公司*、2018最高引用抗体品牌*等!

CST提供高品质的特色信号蛋白及磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、SUMO化等翻译后修饰抗体,蛋白翻译后修饰筛选试剂盒及服务,还有偶联抗体,二抗,ChIP试剂盒,细胞因子ELISA试剂盒,细胞检测试剂盒,蛋白实验配套试剂等,为您提供蛋白相关实验的一站式解决方案。

*数据来自 2015~2019 年 CiteAb、2011&2014 年 LSIA 以及 2015&2017 年 Biocompare 发表的关于抗体市场概述和行业调查的报告。


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