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人KI-67免疫组化试剂盒
2019-01-11 23:41   来源: 上海研谨生物科技有限公司  点击次数: 关键词: 特异性KI-67抗原
KI-67 免疫组化试剂盒
该试剂盒以HRP标记的链霉亲和素复合物(HRP Streptavidin Conjugate,HRP-SA)为基础,可用于检测细胞、组织内的特异性KI-67抗原。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、定性定位准确、背景清晰。在所用的KI-67一抗与相应靶抗原结合后,用生物化二抗与一抗特异性结合,最后加入HRP-SA,形成抗原—特异一抗—生物素化二抗—HRP-SA复合物,显微镜下观察成像。
注:本产品仅供实验室科学研究。本步骤是根据我们长期实验得出的有效步骤,不一定是最优方法,请客户根据具体科研实验情况进行调整和优化,并欢迎客户和我们探讨。





试剂盒所含试剂:
试剂A 通透液:0.1% Triton-X 100   10 mL(选用)
试剂B 封闭缓冲液(封闭用) 20 mL
试剂C (原装进口分装)已稀释的即用型KI-67一抗(2.5ml)
试剂D (原装进口分装)生物素化羊抗兔IgG 1支
(浓度1.5 mg/mL,稀释比为1:300~1:500)50 μL+抗体稀释液20ml
试剂E HRP-SA复合物1支(浓度1 μM,稀释比1:50~1:200)100 μL
试剂F DAB显色液 5ml
用户自备试剂:
1. 10mM TBS(pH7.2~7.4)
三羟基氨基甲1.21g
氯化钠7.6g
加蒸馏水800mL,浓盐酸调pH值至7.2~7.4,最后定容至1000mL
TBS-T:TBS+Tween 20(0.05%体积比)
2.抗原修复液(依检测抗原不同而选择不同的修复液)
10mM pH6.0 柠檬酸缓冲液
柠檬酸0.38g
柠檬酸三钠2.45g
加蒸馏水900mL,浓盐酸调pH值至6.0,最后定容至1000mL
或:0.5M EDTA修复液(pH8.0)
EDTA·2H2O 186.1g
柠檬酸三钠2.45g
加蒸馏水700mL,用10mM NaOH调pH值至8.0,最后定容至1000Ml
3. 缓冲甘油封固剂10 mL
4. Tween 20 5 mL


石蜡包埋组织切片免疫染色
实验步骤(建议方案):
石蜡包埋组织切片3~4μm 厚度
1.烤片: 将待做切片置于切片架上,于60℃恒温烤箱中至少烤1 hr;
2.脱蜡: 切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次(即二甲Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),每次10 min;
3.水化: 切片经下行酒精水化,无水乙醇5min,95%乙醇2次(每次2min),85%乙醇2 min;75%乙醇2min,自来水冲洗,ddH2O洗2×2min;
4.抗原修复: 根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复,常采用高压、微波(温度达到98~100℃)或酶消化修复法,室温自然冷却,自来水冲洗,ddH2O洗2×2min,TBS洗涤(2×2min)(具体修复方法见附1)* 注:有些抗原勿需修复,直接进入第5步封闭。
5.封闭: 滴加试剂B,37℃湿盒孵育30 min;
6.加一抗:滴加用试剂C(即用型一抗),37℃湿盒孵育2 hr 或4℃过夜;
7.洗涤: TBS-T洗涤(3×5 min);
8.封闭: 滴加试剂B,37℃湿盒孵育10 min;
9.加二抗: 滴加用抗体稀释液稀释的生物素化二抗(试剂D),37℃湿盒中孵育30 min;
10.洗涤: TBS-T洗涤(3×5 min);
11.封闭: 滴加试剂Tween 20,37℃湿盒孵育封闭20 min;
12.加HRP-SA: 滴加用抗体稀释液稀释的试剂E(1:50~200,终浓度5~20 nM),37℃湿盒中孵育30 min;
13.洗涤: TBS-T洗涤(3×5 min),TBS洗涤(2×5 min);
14.显色:应用DAB溶液(试剂F)显色;
15.复染:自来水充分冲洗,复染,脱水,透明;
16.封片: 待组织标本干后,用试剂缓冲甘油封固剂封片;
17.观察成像: 显微镜下观察成像。
注意事项:
1. 修复后缓冲液须自然冷却,自来水冲洗后方能把切片取出,骤冷有可能导致结晶或抗原封闭。
2. 缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到,用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。
3. 若试剂为微量浓缩液,用前应低速离心,将内盖和管壁附着的溶液离到底部。
4. 封片前一定要换用TBS充分洗涤,以便洗去组织上残留的Tween 20,否则会影响结果观察。
5. 如须复染细胞核,则在封片前复染或直接采用含有染核试剂的封片剂进行封片。
1:
抗原修复方法
常用抗原修复液:柠檬酸缓冲液(0.01M pH6.0)、EDTA抗原修复液(pH8.0或9.0)等等。
一、酶消化修复法
切片脱蜡水化处理,TBS冲洗,在组织上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶,37℃孵育20~30min后TBS冲洗即可。
二、微波抗原修复法
微波盒中加入抗原修复液微波加热至沸腾,将脱蜡水化后的切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,中档或高档继续微波10~15min,取出微波盒冷却至室温后,自来水冲洗,取出切片。因不同微波炉微波处理时间存在差异,须自行调整。
三、直接高压抗原修复法
取修复液于不锈钢高压锅中加热至沸腾,将组织切片置于耐高温切片架上,修复液沸腾后放入切片架,盖上锅盖,待喷气后计时1.5~2.5min即可脱离热源,自然冷却至室温后自来水冲洗,取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复。
四、隔水式高压抗原修复法
不锈钢高压锅中加自来水加热至沸腾,微波盒中加入修复液于微波炉中加热至沸腾,将切片放入微波盒中,再将微波盒放入高压锅中盖上锅盖,待喷气后计时4~8 min即可关闭热源,自然冷却至室温后自来水冲洗,取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复。

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