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WB 条带大小和蛋白预测八字不合?先检查这 5 点!
2019-01-09 15:13   来源: 艾博抗(上海)贸易有限公司(Abcam上海办事处)  点击次数: 关键词:
实验室玄学千千万,预测和结果不符占一半。

WB 实验是各位艾粉们,时常光顾的一个实验。但就是这样一个初级又常用的实验,却会出现各种稀奇古怪的问题。

比如在 WB 实验鉴定蛋白时,我们得到的蛋白质条带大小常常会和预测值有所偏差。这是身患「强迫症」的艾粉们不能忍的。

如果是实验出错或者预测不准这种情况,小艾是没办法跳出手机屏幕救你了。

但这下面的 5 条准则,艾粉们倒是可以珍藏一下,在遇到蛋白质条带大小和预测值偏差的时候,拿出来分析一下。

我们可以对照着这张图来看原因。


下面小艾就来详细地讲解一下这 5 条具体是个啥。

当我们做 WB 实验鉴定蛋白的时候,最喜欢看到的是这样的条带:


但通常,自己做出来的,就会变成这样:
 

 
是生活对我们这些实验小可爱下手了吗?
还是水逆没过去?
为什么 WB 跑了这么多次,
都和预测差了这么多? 

当然不是那些玄学流原因啦。让我们科学地分析一下到底是哪里出了问题。
 
  • 内源性蛋白 or 重组蛋白
查问题要从源头查起,所以各位艾粉们要先看一看样品是内源性蛋白还是重组蛋白?

如果是内源性蛋白还不打紧,如果是重组蛋白,那么马上就要看一看重组蛋白是否为全长序列了。假如样品是重组蛋白,还不是全长序列,那么条带大小一定会和预测大小不一致。
 
  • 多个 isoform 辨仔细
如果确定了样品是内源蛋白,那就要看看我们的目标蛋白是不是有其他的 isoform,这个我们通常会去查看 NCBI 或者 SWISSPROT 来确认。
 

▲ SWISSPROT 会标出有些基因有多种 isoform
 
做着实验,结果换了别的 isoform 可就一顿瞎忙活啦。
 
  • 剪切活化要注意
如果在 SWISSPROT 或者权威的文献里提到了,样品的这个蛋白需要剪切活化,那么结果又要和预测值不同啦。
 
  • 成倍增长多聚体
如果蛋白大小和预测值有明显倍数关系,那就要考虑一下这个蛋白是不是二聚体或者多聚体啦。
 
  • 蛋白修饰要变大
如果排除了以上 4 条原因,预测值和实验结果不一致,那就是因为我们面对的蛋白质,是个善变的对象,它不仅会剪切活化,还有在翻译表达后修饰。

比如:比如甲基化、乙酰化、磷酸化、糖基化、烷基化、生物素化、谷氨酸化、甘氨酸化、硫酸化、异.戊二烯化、硫辛酸化、磷酸泛酰巯基乙.胺基化……balabala。

在不同状态下的蛋白质还会有不同的修饰。加入了官能团肯定会让蛋白质比预测值偏大。在日常的实验中,糖基化是比较常见的修饰,一般会导致跑出来的条带比预测值大那么一些。

▲ SWISSPROT 会给出蛋白质修饰位点信息,各个都有支持依据哦~

让小艾最后再总结一下。

当 WB 大小和预测值不一致时:
  1. 确定蛋白是内源的还是外源的,如果是外源蛋白是不是全长序列;
  2. SWISSPROT 数据库查询该蛋白是否有其他 isoform;
  3. SWISSPROT 和文献查询蛋白质是否有剪切活化,剪切活化造成蛋白变小;
  4. 确定蛋白质是否是二聚体或多聚体。
  5. NCBI 和 SWISSPROT 查询蛋白质表达后是否有修饰,如有修饰会导致蛋白质增大;

以上就是小艾给出的 5 条小贴士,拿去分析下自己的条带问题绝对是绰绰有余了。如果用过了这 5 条,还是没找到问题在哪里,那就要回过头看看是不是预测不准或者实验出错啦。

文章来源:abcam 微信公众号

 

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