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如何选择对的抗体?
2018-12-25 11:58   来源: 上海艾跃(Active Motif)生物科技有限公司  点击次数: 关键词:

抗体是我们实验中常用到的检测试剂,如果实验室中有验证好的抗体,可以直接拿来用,是一件非常幸福的事情。可如果要做到新的检测,面对形形色色的抗体,要如何选出你的 Ab. Right 呢?下面就容小编为你慢慢道来。

抗体,也就是免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig,是由两条约50kDa的重链和两条 25kDa 的轻链通过疏水键和二硫键的链接而构成,通过重链和轻链的N端的可变区来识别抗原表位(epitope)。抗原表位可以是连续的氨基酸所构成的线性表位,也可以是蛋白质折叠后氨基酸序列不连续但空间接近的构象表位。

依据重链的差别,抗体可以分为不同的类和亚类。如人的抗体可分为 IgGIgAIgMIgDIgE 五类,而 IgG 又可以分为 IgG1-IgG4,四个亚类。我们常用的抗体主要是 IgG 类别的,也有少部分IgM 等其它类别的抗体。

抗体不仅可用于识别蛋白质,还可以识别多糖,抗生素,DNA 等。如 Active Motif 提供的可识别不同DNA修饰的抗体(anti-5mCanti-5hmC等)

常见的使用抗体的实验:
Western blot: 蛋白质变性,抗体识别线性表位
IHC/ICC/IF蛋白质固定后经过修复,表位可恢复,抗体识别线性表位/构象表位
ELISA
FACS  蛋白质处于天然状态,抗体识别线性表位/构象表位
Co-IP
ChIP:蛋白质经过固定处理,部分表位可能被掩盖或发生变化,抗体识别线性表位/构象表位

最简单的选择抗体的方式就是查文献看是否有相同的应用,再者是参考抗体公司的检验数据,如Active Motif的网站上会列出抗体经过哪些实验技术的检验,以及应用相关技术所发表的文章,可帮助决定抗体是否适用并提供参考的稀释比例。

此外还有其它一些因素在选择抗体时需要考虑到


1. 一抗的种属来源:一般的实验并没有对一抗的种属有特定要求,但在免疫组化的实验中,如选用与组织样品同物种的一抗,则会因为二抗识别组织中的免疫球蛋白而影响实验结果,因而对此类实验应选择不同物种的一抗。此外,Co-IP 实验中,由于后续的 western blot 时样品中有一抗蛋白的存在,若目的蛋白的大小在 50kDa 左右且与一抗同源,则一抗的重链会对结果造成干扰,因而也应避免使用同源一抗。

2.二抗:二抗应选择抗一抗同物种同类免疫球蛋白的抗体,如一抗为小鼠 IgG 类的抗体,则二抗则为抗小鼠 IgG 的抗体。如一抗为 IgG1 亚类,二抗可以针对这个亚类,也可以用对四个亚类都有效的 anti-IgG。在此基础上,再根据所需要的标记物如酶和荧光基团等来确定抗体。

3.单抗/多抗/重组抗体
单抗是指识别单一表位的抗体。目前单抗的生产是将分泌单一抗体的 B 细胞与骨髓瘤细胞相融合形成杂交瘤细胞,通过培养细胞系来进行的。相对于多抗,单抗的特异性较高,杂带少,在一段时期内较为稳定。但由于单抗识别的表位单一,若表位因化学处理发生变化或表位因蛋白间或蛋白与 DNA 间的结合被掩盖,单抗就无法发挥功能。

多抗,也称为抗血清或血清型抗体,它是通过纯化免疫动物的血清所制备的,可以识别抗原的多个表位,亲和性比单抗高,且无表位被掩盖的顾虑,多抗还可以放大低表达靶蛋白的信号。但多抗有时也会引入较高的背景信号,在缺乏参考资料的情况下,可以通过 Blast 制备多抗的抗原序列来确定是否存在可能干扰实验的同源蛋白,另外多抗的不同制备批次间易存在差异。

尽管杂交瘤细胞系生产的单抗可以在一段时间内保持稳定的抗体性能,我们的 Active Motif 的科学家也采取多种措施来保证抗体质量,如每次生产的抗体都会对其做严格质量检测;保证低传代的杂交瘤在液氮中的保存量,杜绝高传代杂交瘤生产抗体;缩短体外或动物体内培养的时间等等。但不可避免的,杂交瘤细胞系在长期培养后会产生返祖现象不分泌抗体或者分泌无意义轻重链,降低抗体效价,此时就会更换新的杂交瘤系。所以,如果您已经找到适用的单抗/多抗,不妨为为发表文章/毕业多储备两支。如果实验室需要长期稳定无批次差异的高品质抗体,那么重组抗体会是一个很好的选择。

重组抗体Active motif  AbFlex® 重组抗体,是通过获得高亲和性高特异性单抗的基因,构建Active Motif的独特的抗体表达载体进行表达生产。它可以根据实验需要灵活选择抗体标记物和纯化方式,性能稳定,完全消除了批次间的差异,并且生产过程中不需要免疫动物,这样既避免了动物病原体的污染也减少了对实验动物的伤害。
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