首页 > 业内资讯 > 企业动态
血药浓度检检测方法分析
2018-12-24 19:46   来源: 北京百普赛斯生物科技有限公司  点击次数: 关键词:
药物代谢动力学(Pharmacokinetic, PK)是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律,并运用数学原理和方法阐述血药浓度随时间变化规律的一门学科。

血清中血药浓度的检测在药代动力学(pharmacokinetics, PK)实验中比较常见,通过系统性检测动物或人血清中血药浓度来分析药物在动物或人体内的吸收、分布、代谢和排泄(即 ADME)情况。其意义包括预测血药水平,制定最佳给药方案,剂量和给药频度,指导合理用药;分析药物相互作用及浓度监测;设计新药,改进药物剂型,设计合理的给药方案等。

今天小编将给大家比较三种最具代表性的血药浓度检测方法。

ELISA 是抗体药血药浓度检测中最常用的技术。下面比较三种最具代表性的用于治疗性抗体的血药浓度检测方法。

检测方案(以 Rituximab 为例):
 
检测方法 包被 样品 检测
Antigen capture ELISA CD20 待检样品 Goat anti-human IgG
Anti-idiotypic capture ELISA Anti-Rituximab Antibodies 待检样品 Goat anti-human IgG
Bridging ELISA by anti-idiotypic antibodies Anti-Rituximab Antibodies 待检样品 Biotinylated Anti-Rituximab antibodies

Antigen Capture ELISA

检测仪器:BMG CLARIOSTAR 酶标仪

样本信息:Rituximab 血清样本

主要试剂:
Human CD20 蛋白
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (Jackson, Cat.No. 109-035-098)

简要流程:
1. 将 human CD20 以 0.5 µg/well 的浓度包被到板上;
2. 将 rituximab 梯度稀释到人血清中(血清终浓度 0.1%);
3. 将稀释过的 rituximab 加到孔板中;
4. 加入 Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG 二抗;
5. TMB 显色。

检测结果:
为避免非特异背景干扰,该方法对血清样本进行了 1000 倍稀释。由于 CD20 蛋白和抗体的亲和力较弱,因此不能准确估计基质中的抗体药水平(Figure 1)。

Figure 1. Detection of rituximab by antigen-capture ELISA (0.1% serum).


Anti-idiotypic Capture ELISA

检测仪器:BMG CLARIOSTAR 酶标仪

样本信息:Rituximab 血清样本

主要试剂:
Anti-Rituximab Antibodies(ACROBiosystems, Cat. No. RIB-Y35)
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (Jackson, Cat. No. 109-035-098)

简要流程:
1. 将 Anti-Rituximab Antibodies(ACROBiosystems, Cat. No. RIB-Y35)以 0.05 µg/well 的浓度包被到板上;
2. 将 rituximab 梯度稀释到人血清中(血清终浓度 0.1%);
3. 将稀释过的 rituximab 加到孔板中;
4. 加入 Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG 二抗;
5. TMB 显色。

检测结果:
该方法血清样本检测范围为 0.156~10 µg/mL,检测灵敏度为 0.156 µg/mL(Figure 2)。

Figure 2. Detection of rituximab by anti-idiotypic capture ELISA (0.1% serum).


Bridging ELISA by Anti-idiotypic Antibodies

检测仪器:BMG CLARIOSTAR 酶标仪

样本信息:Rituximab 血清样本

主要试剂:
Anti-Rituximab Antibodies(ACROBiosystems, Cat. No. RIB-Y37)
Biotinylated Anti-Rituximab Antibodies
Streptavidin Protein, HRP (Thermo, Cat.No. 21126)

简要流程:
1. 将 Anti-Rituximab Antibodies(ACROBiosystems, Cat. No. RIB-Y37)以 0.2 µg/well 的浓度包被到板上;
2. 将 rituximab 梯度稀释到人血清中(血清终浓度10%);
3. 将稀释过的 rituximab 加到孔板中;
4. 加入 Biotinylated Anti-Rituximab Antibodies;
5. 加入 Streptavidin Protein, HRP 二抗;
6. TMB 显色。

检测结果:
该方法血清样本检测范围为 0.012~0.78 µg/mL,检测灵敏度为 0.012 µg/mL(Figure 3)。

Figure 3. Detection of rituximab by anti-idiotypic bridging ELISA (10% serum).

案例分析对比:

 
检测方法 线性范围µg/mL 灵敏度µg/mL 优点 缺点
Antigen-capture ELISA  方法简单
 通用性好
背景值高
无活性
Anti-idiotypic capture ELISA 0.156-10 0.156 解决了 CD20 获得难的问题;
方法简单
背景高;
只适用于美罗华biosimilar
Bridging ELISA by anti-idiotypic antibodies 0.012-0.78 0.012 解决了 CD20 获得难的问题;
灵敏度好;
背景低
只适用于美罗华biosimilar

比较上文三个案例,antigen-capture ELISA 由于抗原抗体亲和力较弱,不能准确检测出基质中的抗体药浓度。anti-idiotypic capture ELISA 和 bridging ELISA by anti-idiotypic antibodies 采用 anti-idiotypic antibodies 包板,解决了蛋白获得难的问题,但只适用于检测美罗华生物类似药。Anti-idiotypic capture ELISA 检测灵敏度比 Anti-idiotypic capture ELISA 高 10 倍。此外,由于间接法二抗通常选择 Anti-Human IgG,导致非特异背景较高,必须对基质稀释 1000 倍以上才能避免基质干扰。我们用两种方法分别检测了不同稀释倍数下的 24 例给药前病人血清,左图为 indirect ELISA,右图为 bridging ELISA(Figure 4)。从图中我们可以发现,对于 bridging ELISA,我们几乎不需要对样本进行稀释,也能得到非常低的实验背景。
 

Figure 4. Comparison between anti-idiotypic capture ELISA and anti-idiotypic bridging ELISA for rituximab detection in patient samples. Left: anti-idiotypic capture ELISA; Right: anti-idiotypic bridging ELISA.

 
为了缩短抗独特型抗体制备时间,ACROBiosystems 公司开发了一系列高亲和力、高特异性的抗独特型抗体,应用于药代动力学研究。抗独特型抗体 (anti-idiotypic antibody) 是能够识别另一抗体可变区,并产生特异性结合的抗体。对于每一个抗独特型抗体,我们都会根据不同的应用场景开发相应的实验方案,希望最大程度上加速药物研发的进程。目前产品已覆盖 Adalimumab, Rituximab, Cetuximab, Trastuzumab, Bevacizumab 等多个已上市的热门抗体药。

产品列表(不断更新中)
 
Cat. No. Antigen Neutralizing Activity Affinity KD, nM Application
TRB-Y7 Trastuzumab F(ab’)2 Neutralizing Antibody 0.452 ADA assay
Neutralizing assay
Indirect ELISA
ADB-Y19 Adalimumab F(ab’)2 Neutralizing Antibody 0.0013 ADA assay
Neutralizing assay
Indirect ELISA
CEB-Y28 Cetuximab F(ab’)2 Neutralizing Antibody 0.0015 ADA assay
Neutralizing assay
Indirect ELISA
CEB-Y31 Cetuximab F(ab’)2 Non-Neutralizing Antibody 0.421 ADA assay
Indirect ELISA
RIB-Y35 Rituximab F(ab’)2 Neutralizing Antibody 0.03 ADA assay
Neutralizing assay
Indirect ELISA
BEB-Y12 Bevacizumab F(ab’)2 Neutralizing Antibody 0.0828 Neutralizing assay
Indirect ELISA
BEB-Y9 Bevacizumab F(ab’)2 Neutralizing Antibody 1.92 ADA assay
Indirect ELISA

产品特点:

高亲和力
亲和力代表了抗原和抗体间的结合强度,用 KD 值表示,KD 值越小,抗体的亲和力越强。我们用 SPR 方法检测了所有抗独特型抗体的亲和力,了解这一指标,有助于在方法学建立过程中预测检测方法的灵敏度。
 

Anti-Adalimumab Antibodies (mouse IgG1, Cat. No. ADB-Y19) captured on CM5 chip via anti-mouse antibodies surface, can bind human adalimumab with an affinity constant of 1.36 pM.

 
高特异性
对于每一个产品,我们都进行了特异性检测,包括对应的抗体药、抗体药靶点、不同 IgG 亚型和同亚型其他抗体药,只有结合对应的抗体药,而不结合其他蛋白或抗体的产品才会被放行。

Demonstration of the specificity of Anti-Cetuximab Antibodies (Cat. No. CEB-Y28) to the cetuximab.

 
高稳定性
为确保产品稳定性,ACROBiosystems 会做加速实验和冻融实验来验证产品稳定性,只有经过测试证实质量和活性没有任何影响的产品才会被放行。
 
Accelerated Stability Test

Reconstituted Anti-Trastuzumab Antibodies were diluted to 0.4 mg/ml, aliquoted and placed at 37°C. Aliquots were removed from 37°C at every time point and placed at 4°C along with the control. No significant loss of activity was observed.
Freeze-thaw Test

Anti-Trastuzumab Antibodies were subjected to the indicated number of freeze-thaw cycles (FT). No significant loss of activity was observed.

 

点击查看详情 >>

 

版权声明

本网站所有注明“来源:丁香园”的文字、图片和音视频资料,版权均属于丁香园所有,非经授权,任何媒体、网站或个人不得转载,授权转载时须注明“来源:丁香园”。本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的,且明确注明来源和作者,不希望被转载的媒体或个人可与我们联系,我们将立即进行删除处理。

评论

评论 ()

本周

本月

总排行