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间充质干细胞成软骨诱导那些关键事儿
2018-12-12 23:57   来源: 弗元(上海)生物科技有限公司  点击次数: 关键词:
间充质干细胞成软骨诱导那些关键事儿

间充质干细胞在应用与应用基础上的研究无异还是最大的热点细胞之一。2018年,查询一下CFDA,受理的间充质干细胞类药物研究有4项之多,这是以前没见过的。看看备案由医院主导的临床研究,更是一大批,那些已经获得资质的医院可真是不愿浪费这填上掉下来的好机会。抗衰老、美容等那些在官方无法查到的更是无可计数。
闲话不多讲,总是,很火。当然,以临床使用的经验来讲,也是有用的,只是现在由于评价标准和质量标准等的不完全统一导致结果偏差较大。所以,继续研究下去还是很有必要的。
问题是,常用的质量控制标准——形态、分化、表型——中的分化究竟该怎样做好?成骨、成脂好像大家都不避讳,看文献的时候都是有的,那么今天我们就来聊聊成软骨那些事情吧。

首先,成软骨诱导有没有做的必要?
这个不太好回答。我们坚定成脂、成骨、成软骨都是用来证明它是来自中胚层的。但实际上,跨胚层分化也是有可能的。所以,意义已然有些模糊。但个人建议,还是要做的。对于科研来说,多一个数据支撑挺好;对于间充质干细胞药物,没的说,必检。

然后,说说诱导分化的方案。
培养系统首先是无血清的,有人用牛血清白蛋白,有的直接去除血清,本着就简不就繁的原则,建议不用,效果很好。常见的添加物有VC、地塞米松、ITS、bingtong酸钠、TGF-B1或TGF-B3,这里边最重要的是TGF-B,建议使用TGF-B3。置于其他的保证诱导稳定的一些细节,这个各家的试剂盒配方也相同。说了一大堆,其实简单讲就是不要自己配制诱导系统了,买现成的对于鉴定来说更方便。
诱导过程,这个大致有两种,一种是接种在孔板中,一种是在离心管中直接培养。两者的共同处在于结果都是要成小球样。也有贴壁生长不成球的,个人觉得这个方法就不要考虑了,因为成软骨后会分泌软骨蛋白多糖、二型胶原等细胞外基质,这样还能在平面上长我是不太想信的。我们建议,使用离心的方式比较好,原因有两个,一是细胞聚集聚集更利于细胞外基质的相互连接,二是类似三维培养更利于细胞模拟体内状态。简单描述一下过程:用诱导培养基洗细胞1-2次;加诱导培养基离心,培养24小时,紧密聚团,悬浮培养;2天换液一次,新鲜诱导液须复温;持续培养20天,用于检测。注意,每个TEST用的细胞数很重要,太多的话球过大,可能会导致一些细胞死亡,球破裂。太少的话可能难以形成球,会即便形成了球也难进行后续操作。建议细胞数在2×10E6左右,也就是一个T25瓶长到80%左右的量。

检测内容呢?
常用的有阿利新蓝染色、二型胶原染色、qPCR检测,针对的内容不同而已。阿利新蓝针对细胞外基质蛋白多糖,这个是比较容易得到的,但事实上也是不完全的,因为阿利新蓝阳性可能Ⅱ型胶原还没有表达,这样也不算完全的成软骨细胞。也就是说Ⅱ型胶原的检测更可靠一些。然而,问题来了,这两种检测都是定性的,很难量化,对于药品的质量控制方法来说不能量化很尴尬。qPCR,一般要检测一系列的基因,出来的数据也是以数字形式呈现,对于制药来说相对较好。使用qPCR array应该是一个比较好的选择。
阿利新蓝和Ⅱ型胶原染色最好是固定以后包埋、切片再染色,这样好看的多,直接染色简直丑爆了。不过这么小的球进行后续操作有一定的难度,实在不行就找专业的人完成这部分算了。
qPCR检测mRNA的话,将球里的细胞裂解出来是关键。20天左右形成的球已经相当有硬度了,一般操作无法将其完全裂开。建议加入TRIZOL,用组织裂解仪加石英球或钢球充分研磨。只要组织裂解充分,后边的实验就简单了,此处就不多讲。

总结一下。
间充质干细胞鉴定时成软骨诱导还是需要做的;培养系统也不用自己做了,用试剂盒比较划算(有需要可以自己算算这笔账);诱导完成后的检测方法有多重选择,根据自己的具体情况选择吧,如果往药物方向研究,建议用PCR array。
匆匆写了这些,内容不够充分,如有需要可留言交流,我是弗元生物。




 

 

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