提起 PCR,在生物及其相关行业内可谓如雷贯耳,无人不知无人不晓,其影响之深,应用之广可见一斑。 1985 年,美国 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人发明了聚合酶链反应(PCR),实现了在试管中模拟细胞内的 DNA 复制。然而,采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR,由于该酶不耐热,使这一过程耗时,费力,且易出错。1988 年 Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热 DNA 聚合酶。 耐热 DNA 聚合酶的应用使得 PCR 能高效率的进行,随后 PE-Cetus 公司推出了第一台 PCR 自动化热循环仪,从此拉开了 PCR 大展拳脚的序幕。 根据 PCR 的发展进程,本文将对普通 PCR、实时荧光定量 PCR 和数字 PCR 这三代 PCR 进行分析,期望对 PCR 感兴趣的读者能从中有所收获。
基本原理
仪器与耗材
结果检测 PCR 反应扩增出很高的拷贝数,下一步检测就成了关键。荧光素(溴化乙锭,EB)染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性不太高,引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判,但因为其简捷易行,成为了主流检测方法。
应用 PCR 是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊 DNA 复制,最大特点是能将微量的 DNA 大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的 DNA,就能用 PCR 加以放大,进行比对。这也是「微量证据」的威力之所在。
基本原理
模板 DNA 量越多,荧光达到域值的循环数越少,即 Ct 值越小。Log 起始模板浓度与 Ct 呈线性关系,通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,根据样品 Ct 值,就可以计算出样品中所含的模板量。
目前常用荧光标记方法
仪器与耗材 在普通 PCR 仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统,就成了荧光定量 PCR 仪。其 PCR 扩增原理和普通 PCR 仪扩增原理相同,只是 PCR 扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记,使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出,把这 PCR 仪叫做实时荧光定量 PCR 仪 (qPCR 仪)。荧光定量 PCR 仪有单通道,双通道,和多通道。当只用一种荧光探针标记的时候,选用单通道,有多荧光标记的时候用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记的目的基因表达产物,因为一次只能检测一种目的基因的扩增量,需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。该仪器主要用于医学临床检测,生物医药研发,食品行业,科研院校等机构。
实时荧光定量 PCR 与普通 PCR 对比
定性分析研究:杂合或纯合子鉴定,SNP 分析等。 绝对定量研究:病毒和病原菌定量分析,基因拷贝数定量分析,GMO 定量检测等。 相对定量研究:mRNA 表达分析,siRNA 效果确认,差异显示结果验证等。
1992 年,Sykes 等从非淋巴细胞和正常体细胞背景中鉴定突变的白血病细胞,检测了复杂背景下低丰度的 IgH 重链突变基因。该研究中提出了三个重要的原则:有限稀释、终点信号的有或无及对数据泊松分布的统计处理,为以后 dPCR 的发展奠定了基础,逐步拉开了 Digital PCR 研究和应用的序幕......
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