实验简介
质粒具有自主复制能力,使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。是 DNA 重组技术中常用的载体,将某种目标基因片段重组到质粒中,构成重组基因或重组体。然后将其进行提取纯化,通过基因工程手段,送进受体细胞中去进行增殖和表达。质粒是基因治疗、疫苗和转基因等必要手段。
内毒素(革兰氏阴性菌在死亡而溶解或用人工方法破坏菌体而释放),能够影响质粒转染的效率,影响转染过程中质粒 DNA 的吸收,也会激活免疫细胞中的非特异性免疫应答,干扰转染结果。因此,在质粒提取过程中,高效去除内毒素是至关重要步骤之一。
材料与方法
试剂:无内毒素质粒小量提取试剂盒 材料:含有 pEGFP-C1 质粒的 E.coli DH5α 菌液 方法:
- 取 1-5 ml 菌液加入离心管(自备)中,最大转速离心 1 min,弃上清,收集沉淀。
- 向菌体沉淀的离心管中加入 250μl 溶液 P1,使用涡旋振荡器或移液器等充分混匀,确保悬浮所有菌体沉淀。
- 向上述离心管中加入 250μl 溶液 P2, 快速温和地上下颠倒混匀 6-8 次,使菌体完全裂解。
- 向上述离心管中加入 350μl 溶液 P3,快速温和地上下颠倒混匀 6-8 次。此时出现大量白色絮状沉淀。12000rpm 离心 10 min。
- 将步骤 4 中所得的上清液转移至吸附柱中,12000rpm 离心 1 min,倒掉废液,将吸附柱重新装回收集管中。
- 向吸附柱中加入 500μl 溶液 PA,12000rpm 离心 1 min,倒掉废液。
- 向吸附柱中加入 750μl 溶液 PE,12000rpm 离心 1 min,倒掉废液。
- 重复步骤 7 一次。
- 将吸附柱放回收集管中,12,000 rpm (~13,400×g ) 离心 2 min,尽量除尽漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟,彻底地晾干,以防止残留的 PE 影响下一步的实验。
- 将吸附柱放到一个干净离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加适量溶液 EB(50-100μl), 室温放置 2 min。12,000 rpm (~13,400×g ) 离心 1 min 收集质粒 DNA 溶液(请于-20℃ 保存)。
实验结果
质粒浓度 356ng/ul A260=3.308 A280=1.746 260/280=1.89 260/230=2.33
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