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分子克隆原来可以「ze」么快!
2018-10-11 15:25   来源: 汉恒生物科技(上海)有限公司  点击次数: 关键词:
在经过 N 次的 PCR、酶切、连接、转化之后,阳性率依旧很低,到底是哪一步出了问题?无缝克隆,一步法构建同源重组载体或许会解决你的实验难题。
 
 
无缝克隆(Seamless Cloning/In-Fusion Cloning),区别于传统 PCR 产物克隆,差异在于载体末端和引物末端应具有 15~20 个同源碱基,由此得到的 PCR 产物两端便分别带上了 15~20 个与载体序列同源性的碱基,依靠碱基间作用力互补配对成环,无需酶连即可直接用于转化宿主菌,进入宿主菌中的线性质粒(环状)依靠自身酶系将缺口修复。
 
无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的 Gibson Assembly DNA 定向克隆技术,可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。原理示意图如下:
 
 图 1. HB-infusionTM 无缝克隆试剂原理示意图
1. 线性化目的载体(左上);2. PCR 获取目的片段。设计的引物5』需要和线性化载体末端有 15~25 bp 的重叠(图中蓝色和黄色片段,细节可参考图 3);3. 按照一定比例把二者混合在 HB-infusionTM 的 2X 预混液内,50 ℃ 反应 20 min 后直接转化 E.coli 即可。
 
操作步骤详解

1. 制备线性化载体和插入片段

1.1. 载体制备---线性化处理

A. 质粒酶切法

在目标载体质粒上选取合适的位点进行单酶切或双酶切,对酶切后的载体进行割胶纯化。

注:
  1. 为了降低载体自连背景,提高阳性率,建议采用双酶切载体质粒。酶切最好能切出一个较大片段,这样回收的目的条带可以和没有切开的质粒明显分开。
  2. 质粒单酶切容易造成载体切割不完全和自连,导致假阳性的产生。因此,必须单酶切的时候建议延长酶切时间并脱磷处理(酶切 2 h-过夜,CIP 处理 20 min),同时做好空载的对照。
  3. 请务必跑胶回收线性化的载体,否则非线性化质粒会带来极高的背景。
  4. 一种特殊情况:如果采用双酶切彻底线性化载体,而插入片段又没有双酶切的识别位点,也可以跳过纯化步骤,只需热失活内切酶即可用于下一步拼接反应。
B. 质粒 PCR 法
 
 
图 2. PCR 法线性化载体示意图。在插入位点两侧设计一对方向相反的引物对载体进行扩增,通过跑胶回收获取线性化载体片段。
 
选取合适的位点,设计正向和反向引物直接进行载体质粒的 PCR 扩增,一般载体长度均大于 3 kb,建议采用高保真的 DNA 聚合酶扩增。为了避免模板质粒 DNA 对后续试验的影响,建议对 PCR 扩增后的线性化载体进行割胶纯化,去除环状模板质粒,提高阳性率。
 
1.2. 目的插入片段制备

设计引物进行目的片段 PCR 扩增,引物设计要保证目的片段两端有 15~25 bp 序列与线性化载体的两端一致(重叠序列的 Tm³48 °C,可以简单假设 A-T 碱基对=2 ℃,G-C 碱基对=4 ℃)便于拼接反应的进行。PCR 引物包括 5』端与载体同源的 15~25 bp 以及目的片段特异性序列 20~25 bp(见下图 3)。PCR 产物经跑胶纯化待用。

图 3. 采用 HB-infiusionTM 试剂盒时 PCR 上下游引物设计示例。针对双酶切法线性化载体设计插入片段的 PCR 引物,其重叠区域为 15~25 bp+酶切位点,这样重组成功的质粒上会完好保留此两个酶切位点。如果是 PCR 法线性化载体,扩增插入片段的 PCR 引物 5』端直接设计成与线性化载体末端 15~25 bp 重叠即可。
 
2. 冰上融化并且充分混匀 HB-infusionTM Master mix,配制反应体系

 
 
3. 上述反应体系置于 50 ℃ 孵育 20 min(2~3 个片段拼接)/60 min(4~6 个片段拼接)。反应完成之后如不能马上进行后续操作可将反应样品暂储存于-20℃。

4. 转化感受态菌

4.1. 在冰上融化一支 50 μl 的 DH5a 感受态菌 (配合汉恒生物专门为该试剂盒研制的感受态细胞,效果更佳)。

4.2. 取 2 μl 第 3 步中的反应样品加入融化好的感受态菌中,轻轻混匀,不能震荡混匀。将该混合物置于冰上 30 min。

4.3. 轻轻摇匀后放入 42 ℃ 水浴中 1~2 min 进行热激,然后迅速放回冰中,静置 3~5 min。

4.4. 在超净工作台中向上述各管中分别加入 500 μl LB 培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,然后固定到摇床的弹簧架上 37℃ 震荡 1 h,摇床转速 250 rpm。

4.5. 在超净工作台中取上述转化混合液 100~300 μl,分别滴到含合适抗菌素的固体 LB 平板培养皿中,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀(注意:玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂)。37 ℃ 培养箱中培养过夜。

4.6. 挑取平板上的克隆进行 PCR 或者酶切鉴定。



汉恒生物科技(上海)有限公司提供慢病毒载体构建、RNAi(shRNA)、miRNA、过表达和干扰慢病毒包装以及基于慢病毒技术的稳定细胞系构建服务。详情可查询:病毒现货库

 

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