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胚胎的形成是一个机体高度协调配合的过程,其分化过程被严格控制,但具体的调控机制尚不清楚。胚胎干细胞是分离自着床前胚胎内细胞团的永久细胞系,在体外特定条件下可长期培养,具有分化全能性,是体外研究细胞分化过程的合适选择。 环磷酸腺苷 (cAMP, cyclic adenosine monophosphate)-环磷酸腺苷依赖的蛋白激酶 A(PKA, protein kinase A) 信号通路分布于多种细胞中,可以调节细胞的增殖和分化 (如骨髓间充质干细胞、牙髓干细胞等)。cAMP 最为经典的信号通路是通过激活 PKA 实现对细胞功能的调控,细胞受到外界刺激时如受到肾 上腺素刺激时,细胞内 cAMP 浓度上升,随后细胞内四分子的 cAMP 分别与 PKA 的两个调节亚基结合。PKA 结合 cAMP 后,其调节亚基和催化亚基解离,游离的两个催化亚基进入细胞核内作用于下游信号分子如 CREB 等,参与目的基因的转录,从而发挥其对细胞增殖、分化与凋亡等的调节作用。 cAMP-PKA 信号通路在细胞胁迫、再生过程中具有重要作用。本文通过对胚胎细胞早期分化标志物的检测,研究了 PKA 激活及下游的 G9a(EHMT2)甲基化酶在胚胎细胞早期分化过程中的重要调节作用。 本研究中检测内胚层和外胚层标志物 Foxa2 和 Nestin 的抗体来自 Bioss(Anti-Foxa2, bs-2358R;Anti-Nestin, bs-008R)。 日本京都大学干细胞分化团队 Kohei Yamamizu 等以 PKA 为着手点,利用小鼠胚胎干细胞(ESCs)为模型,分析了 cAMP/PKA 信号通路对胚胎干细胞分化的作用及相关信号传导机制。首先,证明了胞内 cAMP 浓度的升高是促使 ESCs 分化的必须条件(Fig1A),通过检测发现 CA-PKA 细胞模型(DoX-,PKA 激活模型,Fig1B)在 D1.5 即有 FlK+ 、PDGFRα+中胚层细胞和 Brachyury+中内胚层细胞生成,与此同时 SSEA1+(未分化 ESCs 标志)细胞比例却明显下降(Fig1C-I),由此可知 PKA 可以在 ESC 分化早期促使 ESC 向中胚层细胞转变。 Fig 1. PKA Accelerates Differentiation Timing of Mesodermal Cells from ESCs 在 PKA 激活状态下,内胚层标志细胞 Foxa2+(Anti-Foxa2, bs-2358R, Bioss)和 Sox17+在 D1.5 出现,在随后的 2 天中持续增多(Fig2A-D);外胚层标记细胞 Nestin+(Anti-Nestin, bs-008R, Bioss)所占比例也自 D1.5 开始呈直线上升趋势(Fig2 G-I)。综上可知,PKA 可以加速小鼠 ESCs 向三胚层细胞的分化。 Fig 2. PKA Accelerates Differentiation Timing of Endodermaland Ectodermal Cells from ESCs 在 ESCs 分化过程中,PKA 与多种基因表达有关,据此推测 PKA 下游信号通路可能会涉及到基因的遗传性修饰。表观遗传因素在细胞全能型和分化相关基因表达的调控中起着重要作用,其中组蛋白甲基化和 DNA 甲基化是表观遗传学的主要机制,参与了异染色质形成、基因印记、基因的转录调控等过程。在本研究中 H3K9me2 在众多组蛋白 H3 甲基化蛋白中表达水平明显增多(Fig3A)。 G9a 是一种具有经典 SET 结构域的组蛋白甲基化转移酶,主要负责常染色质区域组蛋白 H3 中 K9 位点的甲基化,可以促进基因启动子区域组蛋白或 DNA 的甲基化,从而抑制基因转录,其在哺乳动物的胚胎发育和细胞分化过程中起着不可或缺的作用。本研究中发现在 PKA 激活状态下,G9a 蛋白表达水平在细胞分化早期就明显增多,且表达增多节点先于 H3K9me2(Fig3B-C)。 Fig 3. PKA Regulates G9a Expression Accompanied by H3K9me2 and DNA Methylation in Early Differentiation from ESCs ESCs 细胞全能型主要由复杂的转录因子网络调控,其中 Oct3/4 和 nanog 是调控全能型的核心因子,它们的表达变化都会引起细胞分化。在随后的研究中发现在 Oct3/4 和 nanog 的启动子区域 H3K9 的二甲基化比例有所提高,同时 Oct3/4 和 nanog 的启动子区域 DNA 甲基化程度也显著提高。 为进一步确定 PKA 在细胞早期分化的调控作用是由 G9a 所介导,建立了 CA-PKA(Dox-)-G9a-ckO(OHT+)细胞模型(Fig4A-B)。研究结果表明,当 G9a 表达被抑制后,在 PKA 激活状态下优势表达的阳性分化细胞及相关基因启动区的遗传修饰均被消除(Fig4C-M)。后续研究发现 G9a 敲除小鼠胚胎也有类似表达,即更加充分证明了 PKA 和 G9a 共同调控胚胎(干细胞)的早期分化。 Fig 4. Effects of PKA on Early Differentiation Are Dependent on G9a 本研究为我们展示了基于 PKA 和 G9a 共同调控胚胎干细胞分化速度的分子机制(Fig5),有助于我们了解胚胎干细胞(ESC)维持自我更新及多向分化潜能的具体机制,有助于未来更好地将其应用于再生医学研究领域。 Fig 5. Molecular Linkages Regulating Differentiation Timing in Early ESC Differentiation and Embryogenesis 文献来源: Kohei Yamamizu.et al.Protein Kinase A Determines Timing of Early Differentiation through Epigenetic Regulation with G9a. Cell Stem Cell 10,759-770(2012). 能够为科研提供抗体材料支持,是 Bioss 不断坚持的目标。Bioss 抗体引用文献近万篇,除了 Cell 系列杂志,还多次被 Nature、Science 、Leukemia 等权威杂志上的学术论文所引用! 参考文献: Zbigniew Zasłona.et al. Protein kinase A inhibition of macrophage maturation is accompanied by an increase in DNA methylation of the colony‐stimulating factor 1 receptor gene. Immunology 149(2),225–237(2016) |