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测序是筛选差异表达基因的重要手段,筛选到了差异基因,下一步就是对这些差异基因做验证和研究了,那么如何对这些基因进行验证呢? 首先需要对差异基因做定性定量的验证,目的是确定该基因在特定组织(细胞)中的表达量与正常对照组织(细胞)有差异。 然后对差异表达基因的功能进行验证。将基因进行敲除(敲低)和过表达(抑制剂、功能回复实验),确定该基因的差异表达与生理或病理状态相关。 想发高分文章,还少不了对基因调控机制的研究。这时就需要用到互作验证,研究 RNA 与 RNA 或 RNA 与蛋白之间如何作用、调控,最终导致功能改变。 定性定量的验证方法 荧光定量 PCR(qPCR),是最常见的二代测序验证方法。转录组测序基于生物信息分析计算出的多基因表达量会存在一定误差,而 qPCR 可检测特定基因的表达丰度,特异性更高。 PS:如果遇到验证不出来的情况呢?额……直接到文末看看有没有你要的东西吧。 Northern-blot,首先用变性琼脂糖凝胶电泳将分子量大小不同的 RNA 分子进行分离,然后将 RNA 通过印迹转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上,用标记探针与 RNA 杂交并检测,对转录表达进行定性或定量。 (C)荧光原位杂交。用带有荧光标记的核酸探针,与细胞或组织内待检测的靶 DNA 或 RNA 分子杂交,用荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪观察探针的荧光信号,确定靶 DNA(RNA)的亚细胞定位和相对定量分析。 图 荧光原位杂交结果
图片来源 A Novel four-way complex variant translocation involving chromosome 46, XY, t(4;9; 19;22)(q25:q34;p13.3;q11.2) in a chronic myeloid leukemia patient
基因功能验证方法 过表达目的基因。选择目的基因并构建过表达载体,将过表达载体导入细胞中,检测目的基因的表达情况,并观察表型、功能的变化。 敲除(敲低)目的基因。使用 RNA 干扰(RNAi)、CRISPR/Cas9、T-DNA 插入等方法敲除(敲低)目的基因,同时观察表型和功能变化。 回复实验。过表达的同时敲除(敲低)目的基因,或者是在敲除(敲低)的基础上过表达目的基因,观察表型和功能是否回复。 这些方法可应用于 mRNA,lncRNA,miRNA 等功能验证。
图 过表达、敲除验证基因功能
图片来源 The MBNL3 splicing factor promotes hepatocellular carcinoma by increasing PXN expression through the alternative splicing of lncRNA-PXN-AS1
相互作用的研究方法 荧光素酶报告系统,可用于验证 miRNA 与靶基因的互作,也用于检测转录因子与其靶启动子的结合。 RNA pull-down,用于研究 RNA 与蛋白质相互作用。使用 RNA 探针分离与 RNA 结合的蛋白质。
图 RNA pull down 实验
图片来源 RNA–protein analysis using a conditional CRISPR nuclease, PNAS April 2, 2013 110 (14) 5416-5421
RIP-PCR,也是验证 RNA 与蛋白质相互作用的方法。运用针对目标蛋白的抗体把相应的 RNA-蛋白复合物沉淀下来,分离纯化蛋白结合的 RNA,并进行 qPCR 验证。 凝胶阻滞或电泳迁移率实验(EMSA)。是检测蛋白质和核酸序列(DNA 或 RNA)相互结合的技术。
图 EMSA 实验结果图
图片来源 Co-regulation of nuclear respiratory factor-1 by NFκB and CREB links LPS-induced inflammation to mitochondrial biogenesis
除了上述方法,研究调控机制还可能涉及 ChIP-PCR(DNA 与蛋白互作)、GST pull down(蛋白与蛋白互作)等实验。 目的基因从定性定量验证、到基因功能验证、再到基因调控机制探究,既是对基因的认识逐渐深入,也是一步步接近高分文章的过程,可千万别因为测序问题倒在了第一步的验证。选择绝对定量转录组测序,就能 hold 住各种验证,与 qPCR 检测结果高度一致,低丰度基因也轻松通过验证。 转录组测序结果无法用 qPCR 验证,多半是受到建库 PCR 偏好性的影响:比如两个 RNA 分子 A 和 B 表达量是 3:2,但 PCR 偏好性可能导致建库时 B 分子扩增出更多的片段,测序结果 B 表达量反而更高,如下图左图所示,原本表达量为 3:2,但测出来却成了 6:8,跑偏成这样,还可能验证出来吗? 选择绝对定量转录组测序就没有这个烦恼了,它在 PCR 扩增前,给每一个 RNA 分子加上了数字标签 UMI,根据标签识别由 PCR 扩增出来的 RNA 分子,并将它去掉,还原成原始的 RNA 组成比例,如下图右所示,就可以对表达量精确定量了。
图 绝对定量转录组原理
绝对定量转录组测序结果与 qPCR 检测结果高度一致,准确筛选差异表达基因也不在话下。
图 绝对定量转录组测序结果通过 qPCR 验证
建库起始量不要 1000ng ,只要 100 ng、只要 2000 个细胞,更适合稀少珍贵的样本。
图 绝对定量转录组建库扩增不同循环次数,所得结果一致性高于普通转录组
图 植物内生菌互作转录组测序,内生菌参考基因比对率 2.53%
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