Nano Today 10.7 | 牙髓干细胞外泌体“驯服”巨噬细胞！抑制M1极化、阻断ERK/MAPK通路，为椎间盘退变提供无细胞治疗新策略

慢性腰痛的主要病因椎间盘退变（IVDD）全球高发、随龄加剧，现有药物与手术均难以逆转退变进程。越来越多的证据表明，椎间盘局部巨噬细胞向促炎M1型极化、释放大量炎症因子，是驱动退变的核心环节。牙髓干细胞来源外泌体（DPSCs-Exos）具有低免疫原性、高稳定性与旁分泌调控优势，但其对IVDD的治疗效力与机制尚属空白。解放军总医院骨科团队联合北京放射医学研究所团队在【Nano Today】（IF：10.7）发表研究，证实DPSCs-Exos可被巨噬细胞高效内化，通过抑制ERK/MAPK信号通路阻断M1极化、减少促炎因子释放，从而保护髓核（NP）细胞、维持细胞外基质（ECM）稳态，在体外与大鼠尾椎穿刺椎间盘退变模型中显著缓解IVDD，是一种极具转化潜力的无细胞治疗策略。

今天分享的是一篇发表在【Nano Today】（IF：10.7）上题为“Dental pulp mesenchymal stem cell-derived exosomes alleviate intervertebral disc degeneration by inhibition of macrophage M1 polarization”的研究。该研究通过差速超速离心分离DPSCs-Exos，在体内外证实其可抑制LPS诱导的巨噬细胞M1极化并下调IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子、上调IL-10；进一步通过RNA测序锁定ERK/MAPK通路为关键中介，并以ERK特异性抑制剂PD98059在体外与体内验证该通路的必要性，最终揭示“DPSCs-Exos→抑制ERK/MAPK→抑制M1极化→改善椎间盘炎症微环境→保护NP细胞与ECM”的作用链条。

 

研究思路

1.分离与表征DPSCs-Exos：从牙髓干细胞第3–5代上清通过差速超速离心提取外泌体，经透射电镜（TEM）、Western blot（WB）、纳米颗粒追踪分析（NTA）、Zeta电位鉴定其典型外泌体特征，并以PKH67标记验证RAW264.7巨噬细胞对其的高效内化。

2.体外验证DPSCs-Exos抑制M1极化与炎症因子分泌：以100 ng/mL LPS诱导RAW264.7向M1极化，通过流式、WB、免疫荧光与ELISA检测CD80/CD86/iNOS及IL-1β/IL-6/TNF-α/IL-10的变化。

3.验证DPSCs-Exos经巨噬细胞调控保护NP细胞：以Transwell将不同处理后的巨噬细胞与NP细胞共培养，检测NP细胞内炎症因子及ECM合成/降解相关基因（COL2A1、ACAN、ADAMTS5、MMP3、MMP13）表达。

4.体内评估DPSCs-Exos对IVDD的治疗效力：构建大鼠尾椎穿刺椎间盘退变模型，术后椎间盘注射PBS或DPSCs-Exos，于4、8周通过X线、micro-CT、MRI T2及组织学评估退变程度与安全性。

5. RNA测序锁定关键通路：对对照组、LPS组、LPS+DPSCs-Exos组RAW264.7细胞进行转录组测序，经主成分分析（PCA）、热图、火山图、GO/KEGG/GSEA富集分析锁定ERK/MAPK通路，并以WB检测p-ERK/ERK验证。

6. ERK抑制剂PD98059体外验证：以ERK特异性抑制剂PD98059模拟DPSCs-Exos作用，验证抑制ERK/MAPK可复现其抑制M1极化、下调促炎因子及保护NP细胞的效果。

7. ERK抑制剂PD98059体内验证：将PD98059注入退变大鼠椎间盘，验证体内抑制ERK/MAPK可同样缓解IVDD、改善组织学指标。

 

研究结果

1. DPSCs-Exos的表征与巨噬细胞内化验证

图1A：TEM显示DPSCs-Exos呈典型双层膜囊泡结构。

图1B：WB显示DPSCs与DPSCs-Exos均表达外泌体标志物TSG101、CD63、CD81，而Calnexin仅DPSCs表达。

图1C：NTA测得DPSCs-Exos平均粒径约100 nm，浓度1.0×10¹² particles/mL，符合典型外泌体尺寸。

图1D：Zeta电位测定显示DPSCs-Exos的表面电位约−60 mV，显示良好胶体稳定性。

图1E：PKH67标记外泌体与RAW264.7共孵育24 h示意图。

图1F：激光共聚焦显示RAW264.7细胞高效内化DPSCs-Exos。

这些结果表明，成功分离出形态、粒径、标志物均符合外泌体特征的DPSCs-Exos，且能被巨噬细胞高效摄取。

 

2. DPSCs-Exos在体外调节巨噬细胞M1极化和炎症细胞因子分泌

图2A-C：流式细胞术显示LPS组CD80⁺、CD86⁺细胞比例显著高于对照，DPSCs-Exos处理显著逆转该趋势。

图2D-F：免疫荧光分析显示LPS组CD80、CD86荧光强度显著增强，表明RAW264.7细胞明显偏向M1型极化，而DPSCs-Exos干预显著降低荧光信号。

图2G：ELISA显示与对照组相比，LPS组中的IL-1β、IL-6、TNF-水平显著升高，而IL-10含量下降。DPSCs-Exos干预后上清中IL-1β、IL-6、TNF-α显著降低，IL-10含量升高。

这些结果表明，DPSCs-Exos通过下调M1标志物并调控细胞因子分泌发挥显著抗炎作用，有效抑制LPS诱导的巨噬细胞M1极化。

 

3. DPSCs-Exos通过调控巨噬细胞改善NP细胞炎症微环境及细胞外基质平衡

图3A：Transwell间接共培养体系示意图。

图3B：RT-qPCR显示LPS-M组NP细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS mRNA显著升高，LPS+Exos-M组明显降低。

图3C-D：WB印证LPS+Exos-M组NP细胞促炎蛋白表达显著受抑。

图3E：RT-qPCR显示LPS-M组基质降解酶ADAMTS5、MMP3、MMP13上调，合成基因COL2A1、ACAN下调；LPS+Exos-M组显著逆转该趋势。

图3F-G：WB显示LPS+Exos-M组ACAN、COL2A1升高，ADAMTS5、MMP13降低。

图3H-J：免疫荧光显示COL2A1与MMP13表达趋势与WB一致。

这些结果表明，DPSCs-Exos通过抑制巨噬细胞M1极化改善NP细胞炎症环境，从而保护NP细胞功能并维持ECM代谢平衡。

 

4. DPSCs-Exos在尾椎穿刺椎间盘退变模型中缓解IVDD

图4A：动物实验设计方案示意图。

图4B-C、E：X线及显微计算机断层扫描显示PBS组椎间盘高度降低、骨赘形成，DPSCs-Exos组椎间盘高度显著恢复。

图4D、F：磁共振成像T2加权与Pfirrmann分级显示PBS组信号低（失水严重），DPSCs-Exos组信号接近对照组，退变显著减轻。

图4G：HE染色显示各组均有不同程度NP组织丢失；与对照组相比，DPSCs-Exos组NP组织丢失最轻、组织边界清晰可见，而PBS组NP组织几乎消失、被纤维环替代。

图4H：SF染色显示PBS组NP区红色（蛋白聚糖/胶原）染色极少，DPSCs-Exos组保留大量红色染色，提示蛋白聚糖含量丰富。

图4I：COL2A1免疫组化显示对照组棕染丰富，PBS组染色最浅、近乎消失；DPSCs-Exos组染色强度接近对照组。

图4J：CD80免疫组化显示PBS组NP组织中的CD80阳性细胞数量较多，且染色强度较高；而DPSCs-Exos组中的CD80阳性细胞数量显著减少。

这些结果表明，DPSCs-Exos可通过抑制巨噬细胞M1极化，在体内有效延缓大鼠椎间盘退变进展，且生物安全性良好。

 

5. DPSCs-Exos调控巨噬细胞极化的机制

图5A：PCA显示三组基因表达谱明显分离，样本在空间区域清晰聚集。

图5B：Pearson相关性分析显示组内聚集紧密、组间分离清晰，测序数据可靠。

图5C：差异基因热图显示，LPS组与对照组基因表达差异显著，而LPS+DPSCs-Exos组表达谱接近对照组。

图5D：火山图显示与对照组相比，LPS组大量基因显著上调；而与LPS组相比，LPS+Exos组中多数LPS诱导的上调基因显著回落。

图5E：GO富集显示LPS组和对照组中差异表达基因富集于促炎通路，而LPS + Exos 组和LPS组差异基因富集于抗炎通路。

图5F：KEGG显示LPS组上调基因富集于MAPK、TNF、NF-κB等炎症通路，LPS+Exos组下调基因同样富集于此。

图5G：炎症与极化相关基因热图显示与MAPK通路、炎症和极化相关的基因在LPS组中表达水平较高，而在LPS+Exos组中这些基因的表达显著下降，其表达水平接近对照组。

图5H：GSEA证实LPS 处理显著增强了MAPK信号通路的活性，而DPSCs-Exos 处理则有效逆转了这种富集现象。

图5I：WB显示与对照组相比，LPS组p-ERK1/2显著升高；而LPS + Exos组中p-ERK1/2表达水平则明显低于LPS组，总ERK无显著变化。

这些结果表明，DPSCs-Exos通过ERK/MAPK信号通路调控巨噬细胞极化。

 

6. PD98059在体外模拟DPSCs-Exos的治疗效果

图6A-C：流式细胞术结果显示LPS+PD98059组CD80⁺、CD86⁺细胞比例显著低于LPS组，与LPS+DPSCs-Exos组相当。

图6D-E：免疫荧光染色显示LPS+PD98059组CD80、CD86荧光强度显著低于 LPS 组，接近DPSCs-Exos干预水平。

图6F：ELISA显示LPS+PD98059组IL-1β、IL-6、TNF-α显著低于LPS组，与DPSCs-Exos组相近。

这些结果表明，抑制ERK/MAPK通路可模拟DPSCs-Exos对巨噬细胞的调控效应，证实ERK/MAPK通路是DPSCs-Exos调控巨噬细胞的关键靶点。

 

7. PD98059可缓解体内巨噬细胞极化和椎间盘退变

图7A-B、D：X线及显微计算机断层扫描显示PD98059组椎间隙变窄与骨赘形成较PBS组显著减轻，效果与DPSCs-Exos组相当。

图7C、E：磁共振成像T2与Pfirrmann分级显示PD98059组椎间盘退变程度较PBS组显著减轻，接近DPSCs-Exos组。

图7F：HE染色显示显示，PBS组NP细胞数减少、纤维环结构破坏；DPSCs-Exos组与PD98059组NP细胞数增多、纤维环结构完整性改善。

图7G：SF染色显示，PBS组染色强度显著减弱（蛋白聚糖丢失），与PBS组相比，DPSCs-Exos组和PD98059组的染色强度显著增强。

图7H：CD80免疫组化显示CD80免疫组化显示，对照组阳性细胞稀少，DPSCs-Exos组次之；PD98059组较PBS组阳性细胞减少、染色面积缩小。

图7I：COL2A1免疫组化显示对照组强染，PBS组NP区几乎缺失、染色最弱；PD98059组染色面积与强度显著强于PBS组，接近DPSCs-Exos组。

这些结果表明，体内抑制ERK/MAPK通路可抑制M1极化并缓解椎间盘退变，与DPSCs-Exos效应一致，进一步验证该通路的关键作用。

 

研究结论

本研究系统证实牙髓干细胞来源外泌体（DPSCs-Exos）可通过抑制ERK/MAPK信号通路阻断巨噬细胞M1极化、下调IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子并上调IL-10，进而改善椎间盘局部炎症微环境、保护髓核（NP）细胞功能、维持细胞外基质（ECM）稳态，在体外及大鼠尾椎穿刺椎间盘退变模型中均显著缓解IVDD。研究进一步以ERK特异性抑制剂PD98059在体外与体内复现了DPSCs-Exos的治疗效应，确证ERK/MAPK通路为关键中介。该工作阐明了DPSCs-Exos调控巨噬细胞极化的新机制，拓宽了其治疗潜力，为IVDD提供了一种低免疫原性、高稳定性的无细胞治疗新策略，并为开发新型抗炎疗法奠定基础。值得注意的是，DPSCs-Exos通过多种载体协同发挥免疫调控作用，本研究尚未鉴定出直接靶向ERK/MAPK通路的具体活性成分（如miRNA、蛋白、脂质），未来需进一步筛选并验证介导巨噬细胞极化调控的关键功能分子，以深化机制认知、推动临床转化。

 

临床/科研启示

1. 无细胞疗法的新选择：相较活细胞移植，DPSCs-Exos规避了免疫原性、致瘤性与伦理限制，且来源易得、稳定性高，为椎间盘退变等慢性炎症性退行疾病提供了可标准化的递送载体。

2. 机制闭环验证范式：从“外泌体表征→体外极化→NP细胞保护→动物疗效→转录组锁定通路→抑制剂正反求证”形成完整证据链，为外泌体调控免疫微环境类研究提供了可复用的方法学模板。

3. 转化待解的关键问题：研究虽锁定ERK/MAPK为关键通路，但DPSCs-Exos中直接作用于该通路的功能性 cargo（miRNA/蛋白/脂质）尚未阐明，且体内递送以局部注射为主，未来需探索靶向递送与活性成分鉴定以推进临床转化。