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献给初学者:WB 如何 1 分钟蛋白定量(送模板)
2018-03-09 17:44   来源: 生物学霸  点击次数: 关键词:


不管是临床医生和科研工作者,我觉得二者的共同敌人都是一致的,那就是时间。作为一个临床医生,没(zen)事(me)儿(ke)的(neng)时候搞搞科研,必须想尽一切办法对付(挤出)时间。


去年,我们已经成功把 WB 一抗过夜之前的操作时间缩短为 1.5 小时,这样有更多的时间来看(he)文(ka)献(fei)了,最大的好处是天黑之前或者下班之后随时都可以开始 WB,不用担心细胞处理时间长或不能回家过夜的问题了。


不了解的同学可以看看这篇《献给初学者:WB 也有基本套路》,毛老师在丁香园公开课里详细解释了原理和操作,粉丝们的评价还不错。


虽然 WB 的时间大大缩短了,但毛老师依然有点小小的不满意。因为在开始 WB 之前的蛋白定量耗费时间还有点长,如果用 BCA 法的话光孵育就需要半个小时,整个过程耗时接近 1 小时。因此为了配合快速 WB,我们同样需要一个快速蛋白定量的方法。因此今天我们来聊聊如何 1 分钟测出蛋白浓度。



蛋白定量法


开始之前我们有必要复习一下理论知识。蛋白定量至少有 5 种方法: BCA,Bradford,双缩脲法(Biuret 法),Folin 法(Lowry 法)和紫外分光光度计法。


BCA 法的原理是在碱性条件下,氨基酸将二价铜还原为一价铜与 BCA 形成紫颜色的络合物,测定 562 nm 的 OD 值,所以如果样本里有还原剂(比如 DTT)的话就会对 BCA 的结果产生干扰。


Bradford 法(考马斯亮蓝法)是在酸性条件下,加入考马斯亮蓝 G250 与蛋白质(主要是碱性或芳香族氨基酸)结合为蓝色化合物,吸光度值从 465nm 变成 595 nm,最后测定 595 nm 的 OD 值来计算蛋白质浓度。


双缩脲法或 Folin 法由于检测灵敏度不够高,早已被 BCA 或 Bradford 法所代替。


而紫外分光光度计法是利用氨基酸在 280 nm 处有吸收峰来定量,由于不同氨基酸吸收峰值略有不同,故在蛋白质成分单一的情况下使用佳,比如蛋白纯化后估测蛋白的浓度。


每个实验室都有各自的传统,在方法选择上青菜萝卜各有所爱,但绝大部分实验室要么用 BCA 要么用 Bradford 法进行蛋白定量。


下图简单总结了一下 BCA 和 Bradford 法各自的优缺点。




快速测蛋白法


显然,要想加快速度最好是选用 Bradford 法了。但是,Bradford 也存在一些问题,比如标准曲线线性相关性不佳,容易受 Triton,SDS 等去垢剂的影响等等。


好在我们都是站在前人的肩膀上,前人早已开发出去垢剂兼容型的 Bradford 试剂,性能优于常规 Bradford 法,比 BCA 法更快更方便。今天我们讨论的方法就是基于去垢剂兼容型的 Bradford 试剂来快速蛋白定量。不知道上哪里买的同学可以在丁香通上找找。




下图就是用 Bradford 法测出的标准曲线。虽然线性拟合不佳(R = 0.9667),但是二项式吻合度却非常高(R = 0.9994),可以说非常完美了。



下图展示了如何在 excel 中制作二项式标准曲线。



到此为止,前面我们担心的几个问题就已经全部解决了。第一,担心 Triton 或 SDS 的影响,我们用去垢剂兼容性的 Bradford 试剂即可。第二,担心标准曲线不佳,我们用二项式来拟合即可。


下面我们继续利用 excel 的自动化功能进一步提升计算速度。首先,初中的时候大家就学过,解二项式的公式是:



这条曲线是一条开口向下的抛物线,所以取 x 轴上的较小的值就是我们所要的浓度值。为了简单易用,我们可以先命名几个单元格为 background,a,b,c,从酶标仪读取 OD 值之后填入 background,复制标准曲线的光密度值,填入 excel 给出的方程中的 a,b,c 之后,excel 就能自动减去背景计算出浓度了。



整个过程熟练的话 1 分钟足矣,首次操作的同学 2 分钟也就足够了。俗话说好马配好鞍,快速 WB 需得配合快速蛋白定量方能有一气呵成、唯快不破的痛快淋漓。但是,使用这种方法需要注意的几个问题:



注意要点


1. 蛋白浓度不能太高,如果超过了标准曲线的范围(比如 OD>2),那就测量不准了。不仅是本方法,所有基于浓度标准曲线的方法都是如此,比如 ELISA。当然也不能太低了。


2.    大约 10 年前就有文献报道测量双波长,即 A595 和 A450 的比值能够获得良好的线性关系并提高灵敏度,这种方法我试过了,在 0.125-1.5 mg/ml 的范围内准确性不如二项式曲线拟合高。


3.    另外,标准品有可能发生降解导致浓度不准确,建议每次测量时加入一个已知浓度的样本作为校验。我每次都会加入一个 0.1-0.5 mg/ml 的 BSA 标准品,校验一下曲线是否准确。


4.    加入标准品的时候枪头一定不能有残留,否则容易引起较大误差,建议初学者刚开始时做 2 到 3 个标准品复孔。


5.    Bradford 法加完样之后需立刻马上测量,OD 值能稳定保持 10 分钟左右,如果不能马上测量,建议换用 BCA 法。


6.    终极大招:如果你已经是老司机了,还有个方法不用测蛋白浓度,只要在显微镜下估测各组细胞密度差不多,直接提蛋白变性上样跑 WB 即可。但老司机也有翻车的时候,请慎用。


好了,今天就写到这里吧,你们要的 excel 模板(BCA 和 Bradford 法都有)毛老师已经给你们准备好了,生物学霸后台回复 excel 即可下载。



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