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献给初学者:一文看懂 PCR 结果图
2017-04-11 15:11   来源: 丁香园  点击次数: 关键词: RT-PCR PCR 结果图 看图分析

辛辛苦苦提完 RNA,逆转录后一个个孔加完引物和模板,最后进行 RT-PCR,你以为这样就可以美滋滋地坐等结果了?等到一幅下面这样的结果图,不知道对于刚接触 RT-PCR 的你来说内心是否是崩溃的?

这是啥?怎么看?

别急,让我慢慢跟你介绍,看完后你就能准确的分析出你的 RT-PCR 结果了。「这里以 7500 软件为例进行介绍」

1. 首先设置好内参和对照组「在 Analysis Settings 处」,一般我们在上机前会对应设置好的,如果设置好的话可以直接跳至第 3 点。如果没有设置好的话是需要重新进行设置。

2. 点击进去后,选择对应好的内参和对照组。「在 Relative Quantization Settings 选项下」

3.选择好内参和对照组后,我们首先看看 PCR 跑的有没有问题,在这里大家最常会见到的问题是在样品池出现了三角形符号,如下图:

那么这些三角形代表什么意思?没错,聪明的你应该已经想到是这个孔出现了问题,而三角形中的数字是几则代表了孔中有几个问题。具体又是什么问题呢?我们就要通过 analysis 中的 QC Summery 进行查找。

举个栗子,比如图中的 A9 孔,出现了 2,则表示有 2 个问题,第 1 个问题如上图所示,High standard deviation 高的标准偏差,表示可能是你上样时导致的样品复孔之间差异较大。第二个问题则是下图中,系统认定 A9 孔中的数值偏差较大,属于异常值。

当然,还有比较常见的问题是引物二聚体引起的双重峰,如 A4 孔。

4. 溶解曲线「melt curve」:表示随温度升高 DNA 的双螺旋结构降解程度的曲线。总的 DNA 双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度「Tm」,不同序列的 DNA,Tm 值不同。DNA 中 G-C 含量越高,Tm 值越高,成正比关系。正如上面提到的,正常的样品孔溶解曲线应该是单峰的,如下图。如果出现了双峰,则要考虑是否引物设计不合理或者引物过量引起溶解曲线出现多峰的情况。

5. 如果前面的几项都没有太大的问题的话。最后我们看看最重要的结果,也就是目的基因的变化情况了。在内参与对照组选择没错的情况下,点击 gene expression 选项,选中你想查看的样品孔的基因表达情况。

好了,这次的 RT-PCR 看图分析就到这里。最后需要注意的是图中的结果还需要输出进行后续的自行运算得出结果。图中的结果只能给出参考。但大致趋势是相同的,如果还有童鞋想听后续如何计算 RT-PCR 的结果及原理的话,欢迎关注下期的 RT-PCR 结果的计算原理与计算模板。

扫一扫加实验菌微信(微信号:biosyj),交流探讨实验中碰到的问题,备注 丁香通

作者:足球枫子
图片来源:足球枫子

编辑: 齐梦霞2

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