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数字PCR在精准医学领域的十大应用!
2018-05-14 11:24   来源: 新羿生物  点击次数: 关键词:

数字PCR是一种新的核酸检测和定量方法,借助微液滴或微坑,通过单个模板分子的PCR扩增,可实现不依赖于标准曲线和参照样本的准确、绝对定量。数字PCR使得反应更灵敏、结果更可靠、展示更直观,尤其适用于微量或痕量DNA检测与定量。下面我们就目前已经比较明确的数字PCR应用方向做个介绍。

基因表达差异研究

数字PCR可以提供比实时荧光定量PCR更精确的基因差异表达研究,尤其对于那些靶基因表达差异微小的情况,如:mRNA、microRNA、lncRNAs等的表达分析;等位基因的不平衡表达;单细胞基因表达分析;外泌体核酸分子定量分析等。

拷贝数变异(CNV)研究

数字PCR直接读取阳性信号,通过泊松分布校正得到目标基因的绝对拷贝数,为拷贝数变异的研究提供了绝对的检测精度。采用数字PCR能够有效对二代测序(NGS)和微阵列比较基因组杂交(aCGH)等实验结果进行验证,并具有检测周期短、成本低、样本通量高等特点。

低丰度DNA模板分子的精确定量

由于绝大部分微液滴中只含单个或不含模板分子,使得低丰度DNA模板分子的扩增不受高丰度模板分子扩增的竞争抑制:与此同时,样品中可能存在的抑制剂也在分配到微液滴的过程中进行了相对稀释,作用于单个微液滴内模板扩增的抑制剂数量大幅降低,从而提高PCR扩增对抑制剂的耐受程度,因此可应用于诸多临床样品(如血液、尿液、粪便、痰液、胸腹水、脑脊液等)中痕量核酸标记物的检测。一般而言,定量PCR的检测灵敏度约在1%,NGS的灵敏度可达到1%,而数字PCR的检测下限可轻松实现0.01%。

甲基化含量鉴定

传统的亚硫酸氢盐处理后的克隆测序法、抗体检测法、定量PCR检测法等受限于方法学的问题,不能获得甲基化程度的精确定量,而数字PCR系统通过对样品的微液滴处理及目标分子的绝对拷贝数定量,为甲基化程度的精确定量检测提供了一种可靠的技术。

二代测序辅助建库

目前靶向测序建库方法包括扩增子方法,在均相溶液中,当扩增引物增加时,由于扩增引物之间的相互作用,从而影响扩增的效率;如果将其分散到大量微液滴中扩增,将可大大降低引物间相互作用,提高扩增效率。同时还可以实现对于少量模板的有效扩增,得到更多的有效测序数据。

CRISPR-Cas9基因编辑结果验证

CRISPR-Cas9技术的发明,是基因编辑技术的一大突破,但如何验证实验是否成功,仍需要高灵敏度的检测方法,数字PCR技术可以满足这一需求。Broad研究所张锋团队发明了以CRISPR为基础的SHERLOCK技术可以对核酸进行高灵敏度的定性检测,但精确定量评估时仍采取了数字PCR进行确认。

肿瘤治疗的伴随诊断

常用体液来源(如血液,胸腹水,唾液及尿液等)的待检标本中的DNA,有正常脱落体细胞和病变脱落细胞两种来源,前者的量远大于后者。通过微液滴处理能在每个微液滴中有效减少正常体细胞DNA的干扰,实现肿瘤标记物的有效检测,如EGFR,ALK,ROS1,KRAS、BRAF等基因的突变检测、乳腺癌/胃癌的HER2基因扩增检测等,应用于肿瘤精准医学的伴随诊断。

肿瘤治疗的实时监控

已有数篇文章报道了使用数字PCR技术对患者治疗过程中的循环肿瘤DNA(ctDNA)进行检测,实时监控疾病进展。在非小细胞肺癌、乳腺癌和肠癌等多种肿瘤患者中都取得了令人鼓舞的结果。与影像学及其他常规指标相比,ctDNA突变及丰度改变通常会提前数月出现,这样就可以提醒医生及时调整治疗方案,使患者得到更有效的治疗。

无创产前筛查

唐氏综合征、地中海贫血或胎儿遗传性耳聋基因检测等,目前无创检测标本来源主要为孕妇血液,检测胎儿DNA会受到母体DNA的干扰,依靠数字PCR可提高检测准确性。对比NGS,数字PCR技术可以提高工作效率、降低检测成本。

微生物(病毒、细菌等)的检测

疾病预防控制中心、出入境检验检疫局系统的实验室可以将基于TaqMan探针法的定量PCR体系无缝地转移到数字PCR上,从而满足该类实验室对于检测结果的要求:灵敏度更高、重复性更好、无需依赖标准曲线的绝对定量结果。

其他应用

数字PCR还可以用于转基因成分的检测、移植排斥监控、肠道菌群分析以及药物基因组检测等领域。

随着数字PCR荧光通道的增加和多指标检测的成熟,数字PCR将会进入更多应用领域,有力推动生命科学、医学诊断、检验检疫、农业等领域的快速发展。

编辑: 小桔灯

 

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