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抗体工匠必读|单抗生产工艺的发展趋势
2018-01-30 11:03   来源: 抗体圈  点击次数: 关键词:

摘要:单抗确立了治疗用生物制品的领导地位。建立健全的生产平台是抗体药物发现成果无缝转化为临床和成功上市的关键。一些领导者正在影响单抗生产工艺的设计。生物类似药的出现使得降低药品费用和生物制品的全球化生产成为可能。目前,单抗很容易在哺乳动物细胞培养中实现高表达。这些驱动因素导至了平台工艺的发现重大改进。此外,为实现这些需求,生物药生产工艺也有了一些新趋势。包括不同表达系统的评价,连续培养和非层析纯化工艺。本文讨论了这些驱动因素在单抗生产工艺中所产生的变化。请点击QA福利PDA技术报告下载

1 单抗平台工艺介绍

目前单抗是最成功的一类生物制品。批准上市的单抗数量已超过50种,到2020年销售额有望超过1250亿美元。能够与特定靶点结合的高度特异性和亲和能力,以及目的蛋白序列易于人源化和全人源化的特性导至这类生物制品的爆炸性增长。最近20年该类产品发展迅猛,目前已有超过300种单抗处于临床试验阶段。单抗已被批准广泛用于恶性肿瘤、免疫学疾病和罕见病等多个适应症。

除了与目标细胞表面靶点的高度特异性结合能力之外,快速开发出强健的生产工艺将单抗候选产品推进临床试验阶段的能力也成为单抗项目顺利推进的关键因素。单抗生产的便捷性和速度使这些候选产品的快速进入临床试验,这些工艺的可扩展性和稳健性可极大地促进了大规模的商业化生产。

蛋白质生产工艺的开发时需要考虑到多个方面,包括杂质去除、稳健性、可扩展性以及使用易于获得的大量供应的原材料。工艺能力不仅要考虑满足早期临床试验所需的规模,也要考虑支持长期供应的需求和规模。因此,充分利用平台方法是开发生产工艺的关键。稳健性、可扩展性和可重复性的水平意味着这些生产工艺看起来与用于实验室纯化少量蛋白的工艺存在明显差异。工艺开发是一项耗时的工作,需要进行大量的试验。因此,只要情况允许,工业界都会倾向于采用平台方法。

从商业角度看,平台方法具有明显的优势。进入临床的速度通常是决定公司成败的关键因素。单抗平台可以在一年之内将项目从基因设计阶段推进到IND阶段,这对于通常需要2年时间进行开发的分子项目来说是一个巨大的进步。减少的试验也意味着研发成本的降低。工艺平台的可预测性使诸如生产和质量控制这样的组织能够采用模板化的文档集,这也减少了在生产和放行检测上花费的时间和资源。单抗的工艺平台使得从启动临床试验一直到产品商业化的全过程生产工艺变得高效和稳健。平台方法的一致性和可预测性极大地促进了这类产品的发展。

单抗非常尤其适用于平台方法的应用。采用成熟的哺乳动物细胞培养系统,可快速和模板化的方式开发稳定的细胞系。已有几个经过优化的表达载体专用于单抗的生产。也有适用于单抗的稳健的流加培养工艺。其中的一些细胞系和培养工艺已用于大规模生产,并深入表征了影响这些工艺的操作参数。细胞系开发和上游细胞培养工艺非常适合采用模板化的方法。然而,对于大多数蛋白质来说,最大的差异是下游纯化工艺,应根据蛋白特性和关键杂质为每种蛋白质设计个性化的纯化工艺。单抗的Fc区能高度特异性的与蛋白A结合,后者是金黄色葡萄球菌的细胞壁组成部分。蛋白质亲和层析法已被广泛应用于单抗生产,层析方法几乎不需要优化即可达到95%以上的纯度。蛋白质A层析后的主要挑战是去除残留的宿主细胞蛋白,高分子量聚合,DNA以及去除病毒污染的能力。领先的生物制药公司已经开发了一些用于生产单抗的下游工序平台。与不能在下游工艺中包含关联步骤的其他蛋白质项目相比,从模板中使用通用的起始方法的能力,可以减少相应的实验数量。

这些下游工艺平台已经成功地使大量的单抗产品进入了临床和商业领域。然而,目前仍有一些新兴趋势在继续塑造生物制药行业。下一节将就领导者的对单抗生产工艺面貌的改变趋势进行讨论。

2 生物制品的驱动改变

许多因素正在推动传统生物制药生产的改变,因为药物的销售价格是由病人的生命和健康的价值决定的,生产成本不被认为是一个重要因素。其结果是,生产成本成为日益关注的焦点。此外,具有生产能力的组织正在寻求更有效地利用现有的工厂,以减少对新工厂建设的需求。在推动工艺创新的背景下,许多因素都被进行检验。

2.1 生物类似药

生物仿制药(一般又被成为生物类似药)的出现是传统生物制药方式的关键改变。

尽管由于自身的复杂性,生物类似药的价格下降并不像小分子药物那样显著,但生物仿制药的焦点仍集中在生产成本上。2005年10月30日,欧盟颁布了“生物类似药品指导原则”。此后,许多大型生物技术公司和大型制药公司宣布成立生物仿制制药公司,其中包括山德士、安进、Biogen(属于三星)、辉瑞和默克雪兰诺公司,预计到2020年生物类似药的市场规模将近200亿美元。美国FDA在接受生物相似药的应用方面更加谨慎,目前已经批准了两种产品, Zarxio(Neupogen生物相似药)和Inflectra (Remicade生物相似药)。而截止至2016年5月,EMA已经批准了22个生物类似药。随着这一趋势在全球范围内不断扩大,生物类似药将显著降低商品成本(COGS)。

2.2 全球化生物制药

随着生物类似药的兴起,人们对全球化生物制药的兴趣也越发浓厚。这也与几个市场对在生物制药本土企业给予优惠待遇有关。中国的情况尤为明显,辉瑞和通用电气联合推出了一种生物类似药生产工厂,名为KU Bio。其他生物制药企业也进入了包括无锡在内的中国市场。2015年12月,中国食品药品监督管理总局(cFDA)宣布,中国将加快药品上市申请的审批程序。在拉丁美洲和南非,生物类似药的本土化生产趋势也开始高涨起来。一系列从事生物药生产的印度公司数量也有明显增长。

2.3. 一次性生产技术

一次性生产技术的增长推动了全球化的生产,这种技术显著降低了基础建设投资。一次性生产技术使全程采用用后即弃的方式迅速用于生产临床样品成为可能。生物制药的一次性生产是一种趋势,现已发展到商业制造领域,已有几家生产厂家先后使用了多个2000L一次性生物反应器来生产生物制药。如安进公司在新加坡的制造工厂利用6×2000L的一次性生物反应器来进行细胞培养。与目前仍处于主导地位的大型不锈钢设备相比,这些技术使生物制药的cGMP生产更容易实现。结合可快速组装的模块化结构,一次性生产成为一种可以在全世界范围内扩展生物制药的技术。

2.4 表达量的提高

最近几十年来,细胞培养的表达量也有显著提高。如今,经14天的批培养后,单抗通常可以达到5 g/L的表达水平。而通过流加生物反应器的持续补料还可以获得更高的表达量。这些进步是由细胞系表达载体的开发、克隆筛选以及细胞培养基的变化所获得的。这种产品表达的增加反过来也促使小型生物反应器(例如2000L一次性生物反应器)能够用于商业生产。

2.5 下游工艺新技术

上游工艺生产率的提高导至下游工序成为生产瓶颈。尽管有人认为目前使用的固定层析工艺能够满足数吨单抗的生产要求,但人们对纯化技术的兴趣仍在增加,以期望其显著提高生产率。近期热点包括对连续生物处理(通常用于连续流加培养和下游操作),以及可以大规模使用的非层析技术。 另一个重新引起关注的领域是非层析分离方式,在这种分离方式可以完全摆脱对层析柱的依赖。

2.6 新一代抗体结构

导至平台方法进化的另一个主要因素是特定的单抗类似构造正被开发为潜在的治疗手段。生物技术产业正迅速超越传统的单抗,涉足包括Fc融合蛋白、双特异性抗体(bsAbs)和融合蛋白在内的各种结构。这些新构造都需要调整原有的单抗平台工艺来支持它们的生产。

Fc融合蛋白是通过将单抗的Fc区域的编码序列与另一种蛋白质的编码序列连接后表达的。Fc区域作为融合部位具有几个优势。许多生物活性肽和蛋白质表现出在肾脏的快速清除,血浆半衰期较短。Fc区域可以与新生的Fc受体结合,延长抗体的半衰期,同时对融合部分也有同样作用。已经批准上市7个Fc的融合蛋白,其中至少有两种(Enbrel和Orencia)每年销售额超过10亿美元,达到重磅炸弹级别。安进公司的单抗原始平台包括了Fc融合蛋白的纯化。然而,对于Fc融合蛋白来说,存在几个关键的下游差异,包括对蛋白裂解的敏感性和比常规的单抗更高的高分子量聚集(HMW)水平的可能性。典型的单抗下游平台方法经过适当调整洗脱条件后通常是可行的,以保证分子的稳定性和多聚体的有效清除。

双特异性抗体(bsAbs)设计为能够同时结合和中和两种不同抗原(配体、细胞受体或细胞因子)或两种不同靶点的蛋白质。由于这一特性,双特异性抗体可以作为调节剂,将免疫效应器和细胞毒性因子,如T细胞,转移到肿瘤或感染细菌内部。抗体的两个手臂不同,这就导至了双特异性抗体的生产工艺的几个挑战。例如,如果抗体的两个单元分别表达,下游工艺需要拆分为两个半部分,然后重新组装以形成一个异质二聚物。除非采用重组工艺,即使采取抑制同二聚物的形成(通过使用一种孔-穴方法或类似的技术以促进异质二聚物的形成),仍会形成少量的同源二聚物,需要在下游处理工艺中移除。因此,这种双特异性抗体的构造需要一个更复杂的下游工艺。

然而,使用一个普通的轻链和孔眼技术(KiH)可以使在细胞培养表达双特异性抗体。由于KiH的构造,使均质聚物的形成受到抑制。如果所选的序列具有生物化学的差异,那么形成的少量的同源二聚物就可以被移除。即使在没有共同的轻链的情况下,也可以做到这一点。例如,来源于Xencor的X单抗技术中,同质二聚物和异质二聚物在其设计的Fc区域中有微小的差异,使它们能够在CEX中分离。该工程改造的另一个目的是提高双特异性抗体的功能效应。

抗体偶联药物(ADC)是一种抗体与细胞毒性剂偶联的一种药物,其主要用于癌症治疗。ADCs下游工序的末端,化学接合步骤除外,其余下游工艺与传统的单抗相同。而这通常需采用超滤/过滤工艺移除未偶联的小分子。与单抗的主要区别在于,由于连接分子的毒性,需要更严格的控制和人员保护。

其他的下一代单抗结构包括在C或N端上对抗体进行融合,以进一步增强同时结合多个靶点的能力。如与抗体结构融合的抗溶蛋白。如图1所示,包括工程scFvs、双抗和三抗,以及以二聚物或三聚物的形式组成的Fab偶合体。如果这些治疗模式成为一种治疗模式,将会导至平台工艺方法的发展。

图1 下一代抗体的可能结构

3 单抗上下游工艺的现状和进展

3.1 单抗平台发展驱动

本节概述了几家大型生物制药公司开发并成功地用于大规模生产单抗生产的下游工序。在这些工艺流程中几个方面是通用的。在哺乳动物细胞培养过程中,单抗被分泌到细胞外的培养基中。收获和复苏规程通常采用离心法,然后是深层过滤和一系列的膜过滤器。如果规模较小,可以使用离心分离法,使用一系列的深层过滤器,这些过滤器通常可以重复使用。平台工艺几乎都是蛋白质A的亲和层析。在某些情况下,可以在蛋白质A层析中增加选择性洗脱方式,从而进一步增强宿主细胞蛋白(HCP)的清除能力。非蛋白A的方案已经被开发出来并用于某些治疗蛋白质商业生产,但由于缺乏通用的方法和处理过程的稳健性,所以尚未普遍应用。按照WHO指导原则,工艺应包含两个不同原理的病毒清除工序。低pH病毒活性和纳滤广泛应用于单抗生产。低pH经典方法是蛋白从蛋白质A层析洗脱后,立即置换低pH值的缓冲液中。蛋白A亲和层析和病毒灭活后,采用一种或两种精制层析法来清除高分子量聚合体、宿主细胞蛋白、DNA,并清除潜在的病毒。各平台方法的主要区别在于不同原理精制层析步骤的顺序。鉴于目前在工业中日益普遍的高表达细胞培养过程(5-10g/L),要求精制层析工艺上有很高的柱载量。

每个公司最终都会根据自己的表达系统和细胞培养过程以及他们在研发中主要使用的单抗类型和子类来定制单抗下游平台的方法。主要的标准是,平台方法需要在不经过显著修改的情况下,在广泛的IgG分子中保持健壮和适用。另一个关键的标准是,平台能够适应生产进度,并尽可能减少在下游处理过程中所花费的时间。因此,另一个关键的驱动因素是各个精制工艺的载量。

3.2 单抗下游平台现状

安进公司是率先披露其下游工艺平台的公司之一。完全模板化的方法被证明是不可行的,但是进行少量的开发实验即可得到符合要求的工艺参数。这些工艺参数的例子包括:蛋白质的洗脱pH值和洗脱层析步骤的选择,这取决于需要清除的杂质的主要成分。图2显示了当时在安进公司中使用的下游平台方案。典型的精制工艺通常采用先阳离子交换层析(CEX)吸附模式,再根据需要采用疏水层析(HIC)的流穿模式去除高聚物,或采用阴离子交换层析(AEX)去除HCP。在少数情况下,会使用羟磷灰石以去除特定的与产品相关杂质。经过第一步精制CEX工序使HCP和HMW达到要求后,采用了AEX膜层析作为第二步病毒灭活工艺。

基因泰克公司另一家率先利用平台方法开发了一种单抗工艺的公司。基因泰克历史上使用CEX和AEX层析法作为其下游平台的一部分(图3),这一趋势最初是利用CEX的结合与洗脱模式作为第一个精制步骤,然后AEX流穿模式。一般单抗的pI显碱性,因此容易与CEX填料紧密结合,也容易在AEX填料中流穿。CEX步骤清除了HMW和HCP。然而,AEX的步骤是需要低电导率才能成功地去除HCP。AEX上样前需要大体积的储罐负荷这可能会导至在操作过程中出现瓶颈。使用混合模式的Captoadhere填料代替传统的AEX填料,有助于减少高倍稀释的需要。

使用AEX的一个主要缺点是只能清除HCPs而不能清除HMW聚合物。可以在优化AEX工艺,采用弱分离模式可以减小这个缺陷,只是这种情况下会有一部分产品保留在填料上。在这种操作模式下,AEX工艺在去除HCP的同时还可去除部分HMW。我们从结构上推测,在电导率非常低条件,填料骨架的某些疏水性部分相互作用能去除部分HMW。

图2 安进公司的单抗下游工艺平台方法


上述两种方案都有一个缺点,即要求对AEX步骤进行大量稀释。此外,CEX和AEX通常无法达到足够的HMW清除效果。

不同单抗HMW水平不一致,但经蛋白质A层析后的HMW的浓度一般不超过5%。这样的水平常常需要像前面提到的那样,采用HIC工艺。另一种创新方法是在不加盐的条件下,高上样量(200g/L)下进行HIC工艺操作。

这种方法需要使用一种高度疏水性的HIC填料,而不需要增加额外的高渗性盐。调节上样前的pH值,以在这种高度过载条件清除HMW。使用这种超高容量的步骤,可以处理大量的单抗,并作为Biogen(图4)的单抗平台的一部分,与AEX流穿模式一起使用。超高上样量精制工艺能力使层析循环数减少,也减少了批生产的上样时间。

图3 基因泰克单抗下游工艺平台

Millipore-Sigma讨论过一种几乎完全采用流穿模式精制的方案。在这种建议中,CEX采用高度过载模式上样。这样操作时,CEX有一定能力清除HCP。我们同样推测,这是由于与层析填料的疏水相互作用造成的。该精制工艺最后以AEX流穿模式完成整个工艺。


图4 Biogen公司单抗下游工艺平台


合同开发和制造(CMDO)需要将许多不同的细胞系和细胞培养过程融入到下游平台方法中。因为需要同时去除HCP和HMW,这对下游平台方案来说是个重大挑战。对下游单抗平台的各种需求如图5所示。不同的细胞系和培养基种类存在很多的可变性,这些都下游工艺平台进行处理。因此,两步精制工艺都需要可以同时清除HMW和HCP。

图5 确定KBI生物制药平台方法所考虑的因素范围

3.3广泛应用的单抗下游平台

CEX和AEX的传统工艺不能完全满足这需求。实现该目标的一个关键修改是使用混合模式层析作为单抗下游平台的一部分。混合模式层析是将疏水基团加入AEX或CEX的骨架结构中。层析填料的疏水性增强,使其在CEX和AEX模式上都得到了改善了去除多聚体的能力,更适合于单抗工艺。此外,这两种层析方式还可同时去除HCP和DNA。不同单抗的亲水性不同。因此KBI公司的平下游台工艺被定义为阴离子交换层析(如Q葡聚糖FF或Capto Q或Fractogel SO3等疏水性填料到Captoadhere或Nuvia cPrime的混合模式填料)。这种对疏水性的调整可以为每一个单抗量身定做最佳的条件。同样的,取决于所选的填料种类,CEX的结合和洗脱工艺也会略微或者中等程度调整疏水性。尽管该方法需要一定程度的实验工作,如果适用于某个单抗,首选方法使用包含AEX和CEX的混合模式层析,这样可以使用较少的疏水性固定相的用量。如图6所示的该流程在KBI公司中包括单抗结构、细胞系和细胞培养工艺的等方面得到广泛应用。

图7显示了,通过这个平台工艺进行了大量的单抗HMW聚合物和HCPs的清除图谱文件。从图中可以看出,采用该平台后,HMW的总水平小于1%, HCP低于50 ppm。特别是对于KBI公司这样的CMDO来说,能够广泛覆盖的不同结构单抗的能力是平台的关键。

图6  KBI生物制药公司为FIH manufacturing采用的单抗下游工艺

图7 KBI生物harma平台DSP方法的性能。(a)HMW结果,(b)HCP结果

4 可能对单抗生产产生影响的新兴工艺技术

各种下游平台工艺可以满足最先进的细胞批培养的单抗生产工艺处理需要。然而,在细胞培养工艺的生产力的提高要求研发替代方法,以提高下游的生产效率。由于希望更充分地利用现有的生产设施,并希望减少生物药的生产成本,这些技术在生物制药领域引起了极大的兴趣。最终目标是将生产的生物仿制药的成本降低到每克10美元。

4.1 连续生产

小分子药物通常采用连续生产方法,以最大限度地提高生产设备的生产效率。然而,而传统的生物制药生产只能采用离散的批生产方式,包括上游细胞培养工艺和下游的层析工艺。在这方面,人们对实现生物制药生产的持续加工的价值越来越感兴趣。流加细胞培养工艺是将新鲜培养基添加到原有培养基中,并不断提取含有产品的培养基,其主要用于不稳定或表达量低的产品。传统的流加培养工艺仅用于培养不能在批培养中达到高水平的被抑制表达或不稳定的产品。然而,出于生产效率的考虑而不是与产品本身有关,近期流加培养工艺正变得越来越普遍。因为不需要等待细胞低的接种量中扩增的时间,而是通过一个连续的连续介质来维持在高细胞密度的生产阶段,流加培养工艺可明显提高生物反应器的生产率。需要大量的细胞培养基的缺点可在后勤上适当解决,这套系统证明花费更高的费用获得更高的生产力合算的。此外,细胞分离技术的改进(如Repligen公司的切向流分离技术)也促进了的流加细胞培养的广泛应用。

在连续流加培养中,产品的纯化可以通过分批层析系统的多个循环来处理,这也引起了对连续的上游和下游工序的重新兴趣。传统的层析是一个批处理过程。步骤从层析柱的卫生处理,平衡,和装载到洗涤,洗脱,脱柱和柱再生,和储存。批处理工艺的通量和生产率是有限的。首先,由于流动分布的限制,层析柱的最大直径只能达到2米。因压力降的限制,填料床高度最高只能装30厘米 (通常是20厘米)。这从根本上限制了单个循环处理产品的数量。当需要多个循环时,中间产品需要保存较长的时间。中间样品储存步骤也需要采用大体积的储罐,这是对生产率的另一个限制。连续的层析分离可以把这个批处理工艺变成连续的或半连续的工艺,如图8所示。结合一个持续的上游流加培养工艺,可以改变目前生物制药生产工艺的设计模式。最近对连续生产工艺的经济分析表明,连续生产工艺可以与传统的批量生产工艺相比,采用一个大幅减小的生物反应器的生产成本基本相同。这可以显著减少建造一个商业化生产的制造设施所需的资本支出。与2.1和2.2节中讨论的一致,该法是推动以低成本生产生物仿制药的驱动因素之一。有分析表明,即使在500L生物反应器的规模下,连续生产工艺也能达到17美元/g的低成本。

连续的层析分离可以采用多种形式进行。周期性的反流层析法是一种形式(来自GE医疗),即采用多个层析柱在操作循环的不同阶段实行连续操作。其他形式包含多柱逆流溶剂梯度净化,采用ChromaCon公司的ContiChrom®系统、Tarpon Biosystems公司(现为颇尔公司)的BioSMB 技术从和Semba Bio公司的Octave 层析系统回收的洗脱峰的前部和尾部以增加产量以及纯度。

最近在该领域的一场争论是,为了尽可能提高的生产率,采用端到端的连续工艺是否需要以及如何实行。为实现该目标需要将多个工艺步骤,包括病毒灭活、超滤/透析和病毒过滤工艺整合为一个连续的流程。随着时间的推移,不断地进步的将会出现,但是否需要一个完全连续的工艺仍有争议。将连续的细胞培养与连续的吸附层析相结合,然后通过在第3.2节中描述的高加载精制工艺完成剩余的单抗下游工序,可能已可以满足需要。

持续生产工艺的进一步发展是不可避免的,并将导至供应商生产数量和营销系统的数量发生改变。这一领域已经克服了一些关键的技术障碍,现在的重点是对这些系统进行大规模的验证,以及使用快速的过程控制技术来改进这些系统的控制。在本文列出的新兴技术领域中,因它仍选用传统的层析填料所,连续生产似乎是第一个将大规模实现的系统。


图8 连续层析原理

4.2 非层析分离

另一种提高生产率的方法是将层析工艺换为非层析工艺。对层析的依赖的一个关键原因是它能够处理大量的宿主细胞蛋白杂质,同时将与产品的性质高度相似的组分的分离。然而,层析步骤是明显的限速步骤,尤其是遇到大批量生产的产品时,比如采用大体积的生物反应器中进行高表达培养时。生物分离依赖的层析工艺,受限于层析柱的床直径和床高度。多数层析填料是可压缩的,这意味着装柱时不能使用低压泵和cGMP生物制药的系统中使用的系统将柱子超过一定高度。此外,目前最大直径的层析柱的直径为2米。因此,即使有了连续的层析,载量仍然是受限的。非层析分离的设想是寻找一个代替层析的方法,一次性处理整批细胞培养收获液的操作实现生物分离。这有可能极大地提高生物制药的生产能力。

使用聚合物的选择性沉淀方案可以在一次操作中捕获整个生物反应器中的产物,而不是依赖于多个层析循环。如果这些类型的单元操作具有高度选择性和一般性质的,它们将会在大规模的生物处理中得到广泛应用。有多种聚合物可以用于单抗的沉淀,如阴离子高聚物沉淀产品和辛酸水解宿主蛋白杂质。不同机制的聚合物的组合可以创造出更好的选择性。例如,盐(高离子强度导至的沉淀)可以与带电的聚合物结合,可以通过电荷的中和作用或者通过蛋白质分子排斥作用的聚乙二醇(聚乙二醇)实行分离。合适的组合有可能产生高度选择性的分离,这样就可以减少下游工序中多个连续的层析工艺的依赖,也有可能设计出具有多种机制的聚合物,实现对宿主细胞蛋白杂质或产品的选择性沉淀。

选择性沉淀的另一个扩展是絮凝生物反应器上清中的细胞。絮凝剂如低pH (< pH 5.0)和聚合剂,如PDDA(polydiallyldimethylammonium chloride)不仅可以用来沉淀细胞和细胞碎片,也沉淀了宿主细胞蛋白质和DNA等杂质。因此,絮凝剂在在收获中在已其其他作用的同时,还可用于大规模去除杂质。在某些情况下可以去除大量的宿主细胞蛋白质,这样就可以减少下游工艺步骤。

双水相萃取(ATPS)通告向溶液中加入混合聚合物和盐或两种聚合物而产生两个分离的水相。如加入PEG-盐和右旋-PEG APTS。已有数个采用ATPS实行高选择性分离的报道。然而,由于分区机制难以开发,而且通常不具备足够的专属性支持单抗之类的蛋白质的分离,所以其大规模应用受到了限制。已有一个PEG/磷酸的ATPS系统实现了从转基因植物提取物中单抗的目的。最近,多步ATPS已经开发出来,试图为多种不同类型的单抗创建一个统一的平台。考虑到分离领域的需求,预计未来ATPS会有更大的发展。

所有这些分离技术都有引入关注的潜力,并且可以大幅提高现有主流生产设备的处理能力。然而,所有这些技术都需要进一步的开发,以使自己成为可扩展的技术,可以在不需要优化的情况下普遍适用于各种单抗的纯化工。

4.3 筛选表达系统

除了哺乳动物细胞培养外,单抗还可以在其他表达系统中产生。进一步发展的一个关键领域是研究替代表达系统,该系统可以产生更高的生产力,同时保留与人类免疫系统兼容的糖基化模式。这些发展可能会使这个领域超越目前最先进的CHO细胞培养。

一个关键的替代表达系统是转基因植物。其中一些系统已经用于临床生产,例如转基因烟草。使用土壤杆菌(Agrobacterium)瞬转获得转基因烟草。这种方法被广泛用于生产中和HIV病毒的抗体。许多公司已经开始使用烟草作为首选的表达系统(Medicago, Kentucky Bioprocessing)。然而,转基因植物表达的挑战仍然包括高水平的内毒素和较低的表达水平。另一种担忧是蛋白酶的分泌,导至植物提取物的有效期缩短。此外,目前对转基因植物生长的担忧限制了这种技术的扩展性,大规模生产的实施有赖于公众的认可。将转基因植物与一般的生态系统分离的要求意味着它们的种植只能局限于大型的、自动化的温室。这限制了这项技术的快速扩展。在这一领域进行了大量的研究,植物表达可能是未来大规模商业生产的一种技术。

大肠杆菌的胞内和胞外均可产生非糖基化单抗和抗体片段。很有吸引力的是大肠杆菌可以快速培养并达到较高的表达水平。然而大肠杆菌没有糖基化机制,因此如果糖基化对活性很重要,这可能是限制其应用的一个重大的不足。目前,大肠杆菌主要作为单抗生产平台的补充,仅用于抗体片段的临床样品生产。

酵母表达系统已被用于临床生产。特别的是,啤酒酵母已用来表达商业多种生物疗法的。然而,一个关键的限制是在啤酒酵母中产生过多的非哺乳动物糖基化模式。此外,由于内质网中错误表达和折叠,啤酒酵母的全长度单抗的表达水平受到了限制。毕赤酵母是一种较好的重组蛋白质表达系统。这是一种可以在非常高的细胞密度下培养的甲基营养酵母。在毕赤酵母系统中使用的启动子非常强大,并且在细胞外分泌的情况下会产生显著的表达水平(高达20 g/L)。毕赤酵母的糖基化比在啤酒酵母中要少。毕赤酵母的工程菌株消除了蛋白酶表达的问题,同时也可抑制了高甘露糖的生成。这个系统面临的另一个挑战是,在这个表达系统中缺少适当的蛋白质折叠伴侣。其结果是,该产品可以以多种形式存在。不过,随着毕赤酵母的工程菌株被开发出来,这一障碍可以被克服。毕赤酵母的高产能使其成为单抗未来的候选对象表达体系。

生物制药生产的另一个新兴平台是微藻生产系统。微藻是一种光合微生物,可在很大数量的发酵器中培养。微藻已被用于工业生物技术产品的生产。当前微藻发酵系统的产量仍然相对较低。在这个表达系统接受生物制药生产之前,还需要克服其他障碍,包括糖基化和其他转录后的修饰。

5 结论

本文讨论了单抗平台方法以及它在加速许多不同疗法向临床和市场的发展的必要性。使用平台方法使许多生物制药公司能够在一年或更短的时间内成功地从基因中取得成功。基于它们的内部抗体结构,细胞株和细胞培养过程,每个生物制药组织已经开发出了它最适宜的平台方法。最新的趋势包括使用多模态层析法作为工艺平台的一部分,以及在一种流动模式下使用两步精制工艺。这些工艺改进使单抗平台的更广泛的适用性,以及对下游处理的吞吐量瓶颈有意义。随着细胞培养能力的不断提高,其他可以提高下游工序生产率的替代形式也在不断发展。这些包括蛋白质在连续模式下的操作,而不是一种批处理模式。可以想象,连续处理可以在未来的整个下游工艺中得到发展。使用沉淀或ATPS的非层析分离工艺是单抗下游工艺的另一个可能的未来方向。下一个十年将会看到单抗下游工艺平台的进一步发展,这是基于生产力和新的分子模型的驱动。

参考文献:

Shukla AA, Wolfe LS, Mostafa SS, Norman C.Evolving trends in mAb production processes.Bioeng Transl Med. 2017 Apr 3;2(1):58-69.

编辑: 小桔灯

 

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