实验方法

EMSA实验问题与解答

2014-01-20 10:06

以下问题是以Promega公司试剂盒为例。

凝胶迁移实验

1)什么是凝胶迁移或电泳迁移率实验?

凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。

在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

2)作这样的实验需要什么试剂?

凝胶迁移实验需要的结合蛋白,可来源于纯化或部分纯化的蛋白,或粗的核和胞质抽提液。还必须制备同位素标记的DNA或RNA。一般,DNA核苷酸探针用g-32P和T4多核苷酸激酶来作末端标记,同位素标记的RNA用噬菌体RNA聚合酶和同位素标记的核苷酸在体外合成。

Promega公司的Riboprobe?/sup系统(a,b)(目录号P1420,P1430,P1440,P1450,P1460)可用于同位素标记的RNA的体外合成,DNA5`末端标记系统(目录号U2010)用于制备DNA探针,结合反应所需的组分有:含盐的溶液(氯化镁,氯化钠,或氯化钾)、缓冲体系(Tris-HCl或HEPES)、还原剂(DTT)、甘油、非特异的竞争DNA(poly(dI:dC)?dI:dC),也可能含非离子去污剂。在结合蛋白和同位素标记的探针作用后,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物,随后将凝胶干燥并放射自显影,或用PhosphorImage?/sup分析。

3)凝胶迁移实验系统提供了什么试剂?

Promega公司提供一种凝胶迁移实验系统检测DNA结合蛋白,系统可作为这类实验的 一种正对照。系统包括目的寡核苷酸,对照DNA结合蛋白,结合缓冲液,用于寡核苷酸探针末端标记所需的试剂。Core 系统(目录号E3050)包括含重组AP2蛋白(AP2抽提液)的大肠杆菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。

AP2抽提液是从表达AP2蛋白的大肠杆菌中提取的。另外,Core系统还含SP1同源寡核苷酸,凝胶迁移结合缓冲液(5′),和能作20次对照实验的HeLa核抽提液。Complete系统(目录号E3300)含另外5个双链寡核苷酸,分别是AP1、OCT1、CREB,、NF-k B、 TFIID结合位点的同源序列。这些寡核苷酸可以在末端标记后用作特异性探针,或在竞争实验中用作非特异性探针。参考凝胶迁移实验技术手册TB110获取更多的资料。

4)成功进行凝胶迁移实验,需要优化哪些因素?

凝胶迁移实验在理论上很简单也很快速,但要成功地进行凝胶迁移实验,需要优化一些参数,这主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响。以下是需要优化的因素:抽提液的制备(核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解),结合蛋白的浓度,探针的浓度,非特异性探针的浓度,缓冲液的配方和pH, 聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件,保温时间和温度,载体蛋白,是否有辅助因子(比如锌,或镉等金属离子,或激素)。

总之,反应总体积应最小(20ul)。为满足一般要求,结合缓冲液含4%甘油,1mMMgCl2, 0.5mMEDTA, 0.5mMDTT, 50mMNaCl, 10mMTris-HCl(pH7.5), 0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC,或10mMHEPES(pH7.9), 50mMKCl, 1mMDTT, 1mMEDTA, 10%甘油,0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC可作为优化实验的起始。参考凝胶迁移实验技术手册TB110获取更多的资料。

5)提供了哪些同源的多核苷酸引物,这些引物的序列来源是什么?

有各类dsDNA探针,它们含各种转录调控因子的同源结合位点。下表列出了所能提供的探针,和这些引物序列的出处。
转录调控因子探针
---------------------------------------
探针名 目录号 序列(上链) 序列的出处
Sp1 E3231,E3232 5`-ATT CGA TCG GGG CGG G GC GCG-3` SV40启动子(1)
AP1 E3201 E3202 5`-CGC TTG ATG AGT CA G CCG GAA-3` 胶原酶基因TRE(2)
AP2 E3211 E3212 5`-GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGG C CC GT -3`人金属硫堇II a(3)
基因NF-kB E3291, E3292, 5`-AGT TGA GGG GAC TTT CC C AGG C-3`鼠Igk轻链基因(4)
Oct1 E3241 E3242 5`-TGT CGA ATG CAA AT C ACT AGA A-3` Ig重链基因(5)
CREB E3281 E3282 5`-AGA GAT TGC CTG ACG TCA GAC AG C TAG-3`大鼠生长激素抑制基因(6)
TFIID E3221 E3222 5`-GCA GAG CAT ATA A GG TGA GGT AGG A -3`belta-1球蛋白启动子
只列出了上链的序列,探针是双链,下链序列和上链序列配对。黑体字表明序列来源于指定的基因序列,转录调控因子结合的序列用下线表明。一般而言,周围的核苷酸是任意。

6)在DNA探针的选择上,要考虑哪些重要因素?

目的DNA的长度应小于300bp,以有利于非结合探针和蛋白DNA复合物的电泳分离。双链的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针。如目的蛋白已被鉴定,则应用短的寡核苷酸片段(约为25bp),这样结合位点可和其他因子的结合位点区别开。长的限制性酶切片段可用于对推定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位。随后可用DNaseI 印迹对蛋白结合的特异区域在DNA序列水平上作出分析。

7)用以下一些转录调节因子和HeLa细胞核抽提物可形成哪些复合物:AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。

当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白的来源时,每1个转录调节因子和它相关的DNA同源序列结合形成特征型的结合形态。以下的文字描述了每一个单独的转录调节因子,包括识别的同源序列,因子的大小,特定的结合条件,以及和HeLa细胞核抽提物可形成的复合物的数目。

1.AP1:AP1(激活蛋白1)是一个转录调节因子,它结合的同源序列为5`-TGAGTCA-3`。当基因的启动子区域存在AP1的结合位点时,这些基因可以被诱导,比如用佛波酯可诱导蛋白激酶C(2,7)。在细胞中,AP1形成c-Jun或Jun相关蛋白的同聚双体,或者形成c-Jun或Jun相关蛋白和c-Fos或Fos相关抗原(Fras)的异源双体。Fos蛋白自身不能形成同聚双体,并不能单独和AP1结合位点结合。c-Jun蛋白是一个40kDa的单体蛋白并通过亮氨酸拉链形成同聚双体。

在HeLa细胞中,AP1的主要形式是c-Jun蛋白的同聚双体。在凝胶迁移实验中,形成一个特异的复合物。当作凝胶迁移实验测定AP1的活力时,除了基本的溶液组分外,应将0.01mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC),100ug BSA, 5mMDTT加入到结合缓冲液中。如用纯化的蛋白,则用1-2ug的蛋白来检测迁移复合物。

2.AP2:AP2是一个转录调节因子,可分别作为TPA-和cAMP诱导因子(10)。它是一个52 kDa的蛋白,识别的同源序列为5`-CCCCAGGC-3`或5`-GCCNNGGC-3`(3)。这个因子对视黄酸特别敏感,可能在形态发生中起着重要作用。HeLa细胞核抽提物和AP2同源DNA探针形成一个特定的复合物。用纯化的蛋白作凝胶迁移实验时,应用20-50ng的蛋白。

3.CREB:CREB是一个37 kDa的转录调节因子,对cAMP应答,识别5`-T(G/T)ACGTCA-3`DNA同源序列(6,11)。它含亮氨酸拉链结构而形成同聚双体,相关的基本结构域和c-JunDNA结合结构域同源。当用HeLa细胞核抽提物时,能和CREB同源序列形成一个复合物。

4.NF-k B:NF-k B最初被鉴定为在B细胞中和免疫球蛋白k 轻链的增强子结合。但随后在非B-细胞的细胞质中被发现,形成NF-k B和Ik B的复合物。最初在DNA结合蛋白复合物中分离的NF-k B是由p65(RelA)和p50构成的异源双聚体。其他分离的单体包括p49(也可称为p52),p75(c-Rel),p68(RelB)。p65,p68,p75单体起反式激活作用。p50,p49(p52)单体具有DNA结合活力,但只具有微量的反式激活作用。

据报道p49和NF-k B的单体p65形成具有转录活力的异源双体,类似于p50/ p65异源双体。p49/ p65和p50/ p65异源双体在细胞质中受一种叫IkBa/MAD-3的抑制剂调节。IkB和p65单体结合,阻制了细胞核中的定位和DNA的结合。在体外高浓度的p65能形成同源双聚体,能和DNA微弱地结合。Poly(dI:dC)能抑制这一反应(14)。p49和p50也能形成同源双聚体,但在细胞中的浓度很低。

通常,在作NF-k B的凝胶迁移实验时,在20ul的反应体积中,有溶于10 mM HEPES的0.28pmoles 的NF-k B9寡核苷酸(pH7.9), 50mMKCl, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油, 0.05%NP-40。当用纯化的蛋白时,250-300ng足以形成凝胶迁移复合物,而需用10ug的HeLa细胞核抽提物。凝胶迁移复合物在室温中保温30分钟,在50mMTris(pH8.3)和38mM甘氨酸的7%聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离凝胶迁移复合物。

含考马斯兰和二甲苯蓝色素的加样溶液只能加入到阴性对照反应中,因这两种色素会加剧NF-k B复合物的解离。当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白来源时,可形成两种序列特异的凝胶迁移复合物,即p50/p50同源双聚体和p50/ p65异源双聚体。

在表达p49,p50,p65的细胞中,可检测到4个序列特异的凝胶迁移复合物(p49/ p49,p50/ p50,p50/ p65,p49/ p65),如果存在高浓度的p65,可检测到微量的p65/p65。下列试剂可加强NF-k B在体外的结合:mM的GTP,ATP,精胺,亚精胺,钡或钙离子,ng的Co+3(NH3)6(12)。

5.OCT1:OCT1是OCT转录调节因子家簇中的一员,显然在哺乳细胞中存在比较广泛(5)。POU结构域包括POU-box和Homeo结构域。当用HeLa细胞核抽提物时,可检测到一个与OCT1同源探针形成的序列同源凝胶迁移复合物。

6.SP1:SP1是一个O-糖基化的转录调节因子,它识别10个核苷酸长度的同源序列5`-GGGGCGGGGC-3`(1)。核心识别序列是5`-GGGGCGGG-3`。同核心序列相似的序列常存在于启动子中。SV40的早期启动子就是一个例子,它是第一个可以结合SP1的启动子。根据糖基化的不同,它的分子量在95-105kDa,DNA结合结构域中的三个锌指纹决定了序列的特异性。HeLa细胞核抽提物与SP1同源探针形成特异的凝胶迁移复合物。

7.TFIID/TFIIB:TFIID和TFIIB是基本的转录调节因子,参与RNA聚合酶II启动子的基本的转录(16)。TFIID与真核启动子的TATA区域形成特异的DNA结合。TFIID由几个蛋白组成,而其中的TATA区域结合蛋白(TBP),参与TATA序列的结合。TFIID的其他的蛋白组分被称为TBP-相关因子(TAFs)。

用TFIID探针寡核苷酸和HeLa细胞核抽提物,可得到一个微弱的凝胶迁移带,但很难确定为是TFIID序列特异凝胶迁移复合物。纯化的重组的TBP很难作凝胶迁移实验,这部分是由于TBP存在很强的正电荷,导致TBP/DNA复合物很难进入凝胶。纯化的TBP形成二聚体后不能结合DNA(17)。因此形成的二聚体可参与DNA结合。TFIIB不单独与DNA结合,但与TFIID结合后增强它与DNA的结合。

TFIIB与预启动复合物结合后,致使RNA聚合酶II和TFIIF结合到转录启始区。故TFIIB在预启动复合物的形成中有重要作用。当用纯化的TFIID作凝胶迁移实验时,poly(dI-dC)不用加入结合反应中。结合缓冲液含10%甘油,20mMTris(pH8.0), 10mMMgCl2, 2mMDTT, 89mMKCl。

对TFIID的凝胶结合实验中,可加入poly(dG:dC)?dG:dC。形成的复合物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离,凝胶组分是:0.5′TBE, 6%聚丙烯酰胺凝胶(19:1丙烯酰胺:双叉),4mMMgCl2, 0.02%NP-40, 电泳缓冲液组分是:0.5′TBE,4mMMgCl2, 0.02%NP-40。

当研究含TFIID和TFIIB的复合物时,应从结合缓冲液,凝胶,和电泳缓冲液中去除MgCl2。这些是一般的要求,用不同的细胞抽提物和TFIID、TFIIB形成复合物作凝胶迁移实验时,应对多种因素进行优化以达到理想的条件。

8)在一次凝胶迁移实验中,用多少量的蛋白质或抽提物,和标记的DNA探针?

对每一个特定的结合蛋白和探针,所用的纯化蛋白,部分纯化蛋白,粗制核抽提液需作优化,一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间,可将蛋白:DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍。用粗制核抽提液,需要1-20ug蛋白形成特异的复合物。

所加入反应的探针的量是50,000-200,000cpm32P-标记的探针(高特异活性),反应体积为1-5ul。这相当于10-50fmoles的DNA探针。探针应保存在-20oC以防止降解,在合成或标记后1-2个星期内必需使用。无论探针或是结合蛋白应避免多次冻融。

9)能用体外翻译法制备目的蛋白质吗?

Promega没对所有的转录调节因子作这类测试。一般,用麦胚抽提物作哺乳细胞转录因子或DNA结合蛋白的体外翻译,兔网织红细胞溶裂解液可能含有内源哺乳细胞转录因子或DNA结合蛋白。但TNT?/sup>兔网织细胞溶解液系统(a,b,c,d)与TranscendTM 生物素标记的tRNA(目录号E3201)一同使用,翻译了转录调节因子AP1(c-Jun),它使AP1同源寡核苷酸(目录号E3201)产生的迁移效果和重组的AP1相同(18)。

TNT?/sup>T7偶联的麦胚抽提物(b,c,d,e)在体外翻译了c-Rel。这一蛋白特异地使免疫球蛋白k 轻链增强子探针产生迁移。在c-Rel结合反应中加入体外翻译的MAD-3(IkB家簇中一员)可干扰其相互作用。

10)poly(dI:dC)?dI:dC),非特异性竞争DNA,特异性竞争DNA的功能是什么?

它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构,可抑制蛋白对标记探针的非特异结合,避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)?dI:dC),可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合,比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时,不必一定加入poly(dI:dC)?dI:dC),如加入,则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液,每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)?dI:dC)。

为确定所形成的复合物的特异性,在含或不含增量的非放射性的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时,作结合反应的竞争实验。一般,非放射性的特异DNA是非标记的DNA探针,非特异的竞争DNA ,长度组成和DNA探针相同,序列不同。用非放射性的特异DNA能竞争掉,而用非特异的竞争DNA不能竞争掉的复合物,表明目的蛋白和同位素标记探针的特异结合。

非特异结合能用特异DNA和非特异的竞争DNA竞争掉。结合溶液中的poly(dI:dC)?dI:dC)的量需作优化,但一般用0.05mg/ml。非放射性的(特异或非特异)的竞争DNA的用量也需优化或滴定,但竞争DNA通常是同位素标记的探针的10-1000倍(w/w)。其他类型的竞争DNA如小牛胸腺DNA不能用于凝胶迁移反应,它们会带有目的蛋白的结合位点。

11)用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开?

将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合,蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%(30:1丙烯酰胺:双叉),在特定条件下可用高或低的浓度。

PH, 聚丙烯酰胺的浓度, 丙烯酰胺:双叉丙烯酰胺的比会影响复合物在凝胶中的迁移。大多数蛋白用10-15伏的电压,解离快的蛋白用短时间和高的电压(30-35伏的电压),电泳时所用的TBE和TAE必需是新配制的,无沉淀。

低的离子强度和丙烯酰胺基质的`箱子效果`有助于复合物的稳定。也可将TGE缓冲液(12.5mMTris,pH8.3, 95mM甘氨酸,0.5mMEDTA)用于不稳定的蛋白/DNA复合物。可在4oC进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。加样样品液中的色素会导致不稳定复合物的解离,应用不含考马斯兰和二甲苯蓝的加样样品液。当带型不紧密出现拖尾时,表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合,以避免带型拖尾。

如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量,或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物,但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染,应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。目前可用高强度琼脂糖凝胶分离蛋白/探针复合物(Metaphor?/sup/agarose)。

12)如何在一个特定的复合物中确定一个蛋白质的存在?

部分纯化的蛋白或粗制核抽提液和一个特定的探针可形成一个或几个特异的蛋白复合物。多个复合物的存在表明蛋白降解,应在制备抽提液的溶液中和结合反应中加入蛋白酶抑制剂。确定复合物中蛋白的特征可能会困难,但有一些方法作这方面的研究。如有目的蛋白的抗体,可进行超迁移实验,抗体和蛋白/探针复合物中的蛋白结合,使复合物的迁移延迟,形成超迁移。增量的抗体加入到结合反应中。抗体可加入到蛋白和探针反应后,也可将抽提物与抗体结合后,再加入探针。

取决于抗体的特定的抗原决定簇,前者有利于超迁移复合物地形成,后者阻止复合物的形成导致原复合物的强度的减少。在大多数实验中,应对抗体作滴定,先使抗体:蛋白的摩尔比为1:1,然后应需要增加抗体的量。当有纯化的蛋白时,可用它们和实验的带型迁移复合物比较。除超迁移实验外,复合物中蛋白的特征也可用UV交联和标记转移来分析。在均质标记的探针和细胞核抽提物保温后,用UV照射使复合物交联,随后用DNA酶降解未保护的探针。

需用均质标记的探针,因DNA酶会从末端标记的探针中除去标记。和保护的几个核苷酸交联的蛋白在变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离,干燥,放射自显影。结合蛋白的分子量可和标准分子参照物比较。也可用目的蛋白的抗体对复合物作Western印迹分析(20)。如一个蛋白和DNA探针的特定序列结合,可用含保守结合序列的竞争寡核苷酸,以及突变体来确定它的特征。也可用定点突变将保守序列结合位点改变来研究复合物的形成。

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