实验方法

菌体/细胞裂解的常用方法和配方汇总

2013-08-05 16:58

由于上次求助无人回应,一气之下遍找资料,汇总出菌体/细胞裂解的常用方法和配方,希望能对其它求助兄弟有所帮助。

一、反复冻融法:

1. 将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。

2. 至少3次以上冻溶。

3. IFCC推荐法:

收集细胞悬液,4℃低温离心(3000rpm,5min),弃上清,加入一定量PBS(200ul),轻轻吹打混匀,-200C 冷冻30 min,370C 解冻,如此反复3次,可形成细胞裂解液。

4. 用液氮冻融三四次就可以了,细胞冻住后,取出放37度水浴,溶解后震荡,再冻

二、超声波处理法

1. 要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。

2. 每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。

3. 100ml菌液离心,用8ml缓冲液悬浮,加8mg溶菌酶,冰浴30min,然后超声处理。750W 40%功率。5秒超声,9秒间隔。超声至少90min。
4. 综合冻融和超声的方法:

1500g离心,弃除上清。冰上,用小体积PBS重悬细胞。

将重悬液集中,1500g离心浓缩,弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞,并搅拌。

可选择:4℃下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl,15mM的DTT。4℃下111500g×60min离心裂解液。取出上清。过柱子。

Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Alternate Protocol

三、渗透法:

冰冷的20 mmol/L Tris-Cl(pH8.0),2.5 mmol/L EDTA处理,冰浴放置10min。

《精编分子生物学实验指南》

四、裂解液处理法:

1. 细胞裂解液:50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8,100 mmol/L DTT,2% SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。

2. 在loading buffer加SDS,100度5分钟,是变性方法。SDS与蛋白等量结合,可以通过条带位移判断蛋白大小,考染不会影响结果。

3. 如果是做小量菌液,跑PAGE胶看其表达情况的话,可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分钟即可,需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟,然后上样时,枪头别吸最底下的。

4. 20毫升细胞裂解液配方:40 μL 0.5M EDTA (PH8.0),4 ml 10% SDS,1 ml 1M Tris-cl(PH6.8),14.96 ml 蒸馏水。

5. 我始终未明白楼主如果想收集全蛋白,而不考虑包涵体的话,为何要用超声呢?直接水煮不就可以了吗?

6. 将1ml菌离心弃上清,留大概50ul,再加50ul 2×上样缓冲液,煮10min,取20ul上样,就可以了。

7. 检测蛋白诱导:

从培养的不同时期各取出1ml,12000g×1min离心。将沉淀重悬于100ul 1×SDS上样缓冲液(50mM Tris-Cl(pH6.8),100mM DTT,2%SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油)中,100℃加热3min,然后12000g×1min离心。上样15ul,6%SDS-PAGE电泳。

《分子克隆》P826

8. 5-10秒离心,弃除上清,用50ul蒸馏水重悬沉淀。加入1ul PMSF,再加入50ul热的2×SDS上样缓冲液(100℃加热)。迅速混匀后100℃加热3-5min。将样品冰上放置(或-20℃放置),然后再溶解,煮沸1min。离心30秒。上样5ul进行SDS-PAGE电泳。

2×SDS上样缓冲液:250mM Tris-Cl,6.2%(w/v)DTT,8%SDS,0.002%(w/v)溴酚蓝,40%甘油。

Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。

9. 裂解液:50mMTris-HCl(pH8.5~9.0),2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,1mg/ml溶菌酶。

10. 我们用NP40(NP40:NONIDET p-40 乙基苯基聚乙二醇,是一种非离子表面活性剂。)加DTT和蛋白酶抑制剂裂解细胞,冰上放30-60min,然后13000rpm离心15min,取上清定量。

11. 裂解液配方是:50mmol/L Tirs-HCI (PH 8.0),150mmol/L NaCI,0. 02% 叠氮钠,100μg/ml PMSF,1μg/ml Aprotinin,1% Triton X-100 ( or NP-40)。

12. 对于组织培养中生长的细胞,最有效的裂解方法是用去污剂(表面活性剂)进行处理,溶解细胞膜并溶解蛋白质。50mmol/L Tirs-HCl(PH 8.0)、150mmol/L NaCl、0. 02% 叠氮钠、100μg/ml PMSF、1μg/ml Aprotinin、1% Triton X-100 ( or NP-40) ,这种裂解液可能是最常用的裂解缓冲液。

13. 细胞裂解液的主要目的:

(1)利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;

(2)溶解蛋白;

(3)蛋白变性使其稳定;

(4)抑制蛋白酶活性。

推荐RIPA buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.4(缓冲体系),150 mM NaCl(等渗体系),1 mM PMSF (强大的蛋白酶抑制剂),1 mM EDTA(变性剂和稳定剂),5 μg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制剂),5 μg/ml Leupeptin(蛋白酶抑制剂),1% Triton x-100(破坏细胞),1% Sodium deoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂),0.1% SDS(强变性剂和蛋白溶解剂)。

14. 裂解buffer:50mM HEPES pH7.0,1mM 甘油,1mM DTT(还原剂),7M 尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解),1mM EDTA(金属鏊合剂),1mM PMSF,1mg/ml leupeptin,1mg/ml aprotinin,1mg/ml pepstatin(蛋白酶抑制剂),50mM NaF(ph7.0)(anti hemoaggulating),1mM Na3VO4(ph7.0)(inhibitor of phosphatases),2mM benzamidine(inhibitor of trypsin)。

15. 可选择:取0.5ml诱导的细胞并离心2min。弃除上清,用100ul 1×SDS上样缓冲液重悬,冰上放置。

6000rpm×10min离心培养物。弃除上清,用10ml预冷的裂解液重悬沉淀。液氮骤冷细胞或-20℃冷冻细胞。在冷水中溶解细胞。15秒、4次超声处理细胞。冰浴降温。4℃,9000g×30min离心。取上清。

裂解液:5 mM DTT,15 mM KCl,5 mM MgCl2,50 mM HEPES, pH 7.9,1 mM EDTA,10 mg/ml溶菌酶(临用前加上DTT和溶菌酶)。

Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Basic Protocol

16. 收集细胞。在液氮中突然冷冻细胞。用含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液悬浮沉淀。用100 μg/ml溶菌酶处理并在冰上孵育15 min。加上10% N-laurylsarcosine (终浓度1.5%),然后超声波破碎。16000 rpm×30 min离心。取上清然后加入Triton X-100至终浓度为2.0%。过Ni-NTA–琼脂糖柱层析。

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