实验方法

测 A260/A280 、A260/A230 就知道 DNA 纯不纯,这是为什么呢?

2018-12-27 15:28

事情的起因是酱紫的,上周日分子生物学公开课上,DANNY 提了这样一个问题。大家还记得不,用紫外吸收法测定核酸浓度与纯度,这个一个非常经典实用的实验,可能会做,不一定知道原理吧?今天我们就来详细的扯一扯。

1.A269、A280、A230 到底是怎么来的?

蛋白质是由氨基酸组成的对不对?这些氨基酸在可见光区都没有光吸收对不对?具体可以去翻看生物教材。但是在紫外光区色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸是有吸收的。他们的最大吸收波长分别是 279、278、259 nm。当用紫外光度法测定这些氨基酸的含量的时候,蛋白质在 280 nm 处的紫外光吸收达到了最大值,绝大部分是色氨酸和酪氨酸引起的。

核酸(包括 DNA 和 RNA)的嘌呤和嘧啶具有共轭双键,使碱基、核苷、核苷酸、和核酸在 240~290 nm 的紫外波段有一个强烈的吸收峰,最大吸收值在 260 nm 左右,而蛋白质在这一区域有很弱的吸收。

230 nm处是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长。

2. 纯 DNA 的 A260/A280 比值为 1.8

3.A260/A280 、A260/A230 有何意义?

A260/A280 、A260/A230 是核酸纯度的指示值。 纯净的样品 A260/A280 大于1.8(DNA)或者 2.0(RNA)。如果比值低于 1.8 或者 2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230 表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物、盐(胍盐)等,较纯净的核酸 A260/A230 的比值大于 2.0 。

参考分子克隆指南三,当 0.5% BSA 蛋白质污染时,蛋白污染会导致 A260 和 A280 的数值都下降,其净结果是 A260/280 比值下降,但 A260/280的比值变化并不显著。但蛋白残留会导致 A230 的数值显著上升,显著影响 A260/230 的比值。

也就是说,如果 RNA 样品的 A260/280=1.7,A260 /230=0.5,那么就应该考虑污染原因不是胍盐残留,而是蛋白残留。

酚的最大吸收峰在 270 nm。酚的残留会显著的增加 A230、A260 、A280 的数值,同时酚的吸收峰与核酸的吸收峰合并后,最大吸收峰向270方向偏移, 也就是说最大吸收峰在 270 nm附近。也就是说,如果 RNA 样品的 A260/280=1~1.5,260/230=1~1.5,那么污染原因就应该考虑是酚残留。

胍盐对 RNA 样品吸收有显著影响,会在小于 230 nm处产生大的吸收峰。胍盐残留不会影响 260 和 280 的数值,对 260/280 的比值不会造成大的影响,当然也不影响RNA定量。但胍盐残留对 A260/230 比值具有明显影响。比如 A260/230 的比值小于 0.21 时,A260/280 的比值还>2。

也就是说,如果 RNA 样品的 A260/280>=2,A260/230<1,那么污染原因就应该考虑是胍盐残留。

当 A260/230<1 时,只有两种情况。一是胍盐污染,二是蛋白污染。

4.TIPs

用分光光度计测量 RNA 时,用水而不是用 TE 缓冲液稀释 RNA 样品会造成 A260/A280 比值下降。原因是低离子强度和低 pH 溶液会增加 280 nm 处的光吸收值。

加氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多 ,那样就很容易被蛋白污染,所以现在一般取 400 uL 左右。

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来源:生物学霸

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