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200~2000次
EdU-647细胞增殖检测试剂盒
EdU Cell Proliferation Kit with Alexa Fluor 647
本产品冰袋运输;-20℃避光保存,保质期12个月。
货号规格
goodCX004L 50~500次
goodCX004L 200~2000次
产品内容
组分名称 | CX004 | CX004L |
EdU(10mM) | 200 μL | 800 μL |
647 Azide | 55 μL | 220 μL |
Click Reaction Buffer | 30 mL | 120 mL |
CuSO4 | 1.5 mL | 6 mL |
Click Additive | 2管 | 1瓶 |
Hoechst 33342(1000×) | 50 μL | 200 μL |
产品特点
gd反应简单——基于简单高效的点击反应,无需DNA变性;
gd灵敏度高——只需少量的小分子叠氮化物探针即可非常有效地标记出掺入的EdU,并且可以检测到单个细胞的增殖情况;
gd操作便捷——只需常用的多聚甲固定和Triton X-100穿透,就可以使叠氮化物探针有效进入细胞并发生点击反应;
gd兼容性好——不影响细胞形态,也不会影响后续的免疫荧光和免疫组化检测,以及DNA的荧光染色。
产品简介
good本产品通过在DNA合成过程中掺入胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine)类似物EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine),并在随后的点击反应(Click reaction)中将EdU标记上荧光染料Alexa Fluor 647,从而实现对细胞增殖进行简单、快速、高灵敏的检测。检测的对象包括培养的细胞或组织样品,也可检测组织切片。经试剂盒处理后的增殖细胞会发出较强的远红外荧光,可被多种成像系统(如激光共聚焦显微镜等)或有相应激发和发射检测模块的流式细胞仪或荧光酶标仪所检测到,也可进行高内涵筛选(High-Content Screening,HCS)。需注意的是,流式细胞仪或荧光酶标仪检测仅适用于细胞样品,不可用于组织切片。
good本试剂盒包含EdU法检测所需的所有试剂组分,除检测细胞增殖外,还可用于细胞周期分析,为此,试剂盒中提供了蓝色细胞核染料Hoechst 33342。
产品简介
小鼠腹腔注射EdU-647 4h后检测多种组织器官的细胞增殖实例
自备试剂
缓冲液 | 推荐配方 |
固定液 | 4%的多聚甲quan |
洗涤液 | 含3% BSA的PBS |
通透液 | 含0.3% Triton X-100的PBS |
操作步骤
good◈ 细胞的EdU标记
good◈ 如下步骤以6孔板检测体系为例,如使用其它型号培养板,检测体系可以按相应比例调整。
good◈goo1. 在6孔板中(如有必要可以放入盖玻片)培养适量细胞。待细胞培养过夜且恢复到正常状态后,进行所需的药物处理或者其它刺激处理等;
good◈goo2. 配制2×EdU工作液:推荐EdU终浓度为10 μM(1×),用细胞培养液1:500稀释EdU(10 mM)即可得到2×EdU工作液(20 μM);
good◈goo2. 注:◎ 对于A549、HeLa和NIH/3T3等贴壁细胞,推荐EdU的使用终浓度为10 μM(1×)。但细胞类型、培养液种类、细胞密度以及细胞增殖速度等多方面因素都会影响EdU掺入到细胞中的效率,故初次使用时建议进行预实验以确定EdU的最佳使用浓度;
good◈goo2. 注:◎ 由于EdU工作液需与培养液等体积加入培养板中,故需要配制成2×工作液。
good◈goo3. 将37℃预热的2×EdU工作液(20 μM),等体积加入6孔板中,使6孔板中的EdU终浓度变为1×。例如设计终浓度为10 μM,原先6孔板中的培养基为1 mL,则只需将1 mL 2×的EdU工作液(20 μM)加入到孔板中即可;
good◈goo2. 注:◎ 如果培养基体积过大,可以先吸除适量的培养液,再加入等体积的2×EdU工作液;
good◈gddoddddddo2. 或者可以减少工作液的体积并提高EdU的浓度,使最终培养液中的EdU浓度为10 μM,
good◈goddddddddo2. 例如2 mL培养液中加入220 μL 0.1 mM EdU;
good◈goo2. 注:◎ 不建议替换所有的培养液,以免对细胞的增殖造成影响。
good◈goo4. 继续孵育细胞2 h。该孵育时间的长短取决于细胞生长速率,通常继续孵育时间以细胞周期10%左右为宜;
good◈goo2. 注:◎ 对于常见的哺乳动物细胞如HeLa、3T3、HEK293等,细胞周期约为18~25 h,孵育时间以2 h左右为宜;
good◈goo2. 注:◎ 人胚胎细胞的细胞周期约为30 min,推荐孵育时间为5 min;
good◈goo2. 注:◎ 酵母细胞的细胞周期约3 h,推荐孵育时间为20 min;
good◈goo2. 注:◎ 对于增殖的神经细胞,细胞周期约5天,推荐的孵育时间为1天;
good◈goo2. 注:◎ 当孵育时间小于45 min时,建议提高EdU的浓度;如孵育时间大于20 h,则建议适当降低EdU的浓度。
good◈goo5. 细胞的EdU标记完成后,吸弃培养液,并加入1 mL 固定液 ,室温固定15 min;
good◈goo2. 注:对于流式细胞仪检测,贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬后再固定。
good◈goo6. 去除 固定液 ,每孔加入1 mL 洗涤液 洗涤细胞3次,每次3~5 min;
good◈goo7. 去除 洗涤液 ,每孔加入1 mL 通透液 ,室温孵育10~15 min;
good◈goo8. 去除 通透液 ,每孔用 1mL 洗涤液洗涤细胞1~2次,每次3~5 min;
good◈goo9. 转至步骤 EdU检测;
good◈ 动物体内的EdU标记
good◈ EdU可以通过注射或进食等适当方式进行动物的体内标记。如下以小鼠为例,其它动物体内的EdU标记请参考相关文献。
good◈goo1. 参照每千克体重10~200 mg Edu用量,使用PBS将Edu配制成合适浓度,并通过腹腔注射、特定组织或器官局部注射、加入饮用水中等方式注入小鼠体内;
good◈goo2. 注:◎ 此步骤中 EdU 用量较大,需额外购买(货号:CX000);
good◈goo2. odd◈g◎ 具体用量跟实验动物的种类、体重和 EdU 注入方式有关,可以参考相关文献,建议初次使用时可对 EdU 的用量进行一定的摸索,或者直接按照每千克体重 50 mg 的用量进行测试。
good◈goo2. odddd◈g如果之前使用过 BrdU 进行实验,则可以按 BrdU 的用量操作。
good◈goo2. 4 h后或根据特定实验确定的适当时间后,快速处死小鼠,取出所需的组织,按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU标记的时长也可以参考相关文献自行调整;
good◈goo3. 对于冰冻切片:
good◈goo2.(1)加入适量 固定液 ,室温固定15 min;
good◈goo2.(2)去除 固定液 ,用适量 洗涤液 洗涤3次,每次 3~5 min;
good◈goo2.(3)去除 洗涤液 ,用适量 通透液 ,室温孵育 10~15 min;
good◈goo2.(4)去除 通透液 ,用适量 洗涤液 洗涤1~2次,每次 3~5 min;
good◈goo2.(5)抗原修复(选做):如果同时需要进行目的蛋白的免疫荧光染色,并有必要进行抗原修复,可以使用适当的抗原修复液进行抗原修复处理;
good◈goo2.(6)转至步骤 EdU检测;
good◈goo4. 对于石蜡切片:
good◈goo2.(1)脱蜡:将石蜡切片置于二甲苯中浸泡10 min;换用新鲜二甲苯再浸泡10 min;更换50%的二甲苯再浸泡5 min;无水乙醇中浸泡5 min;更换新的无水乙醇再浸泡5 min;更换95%乙醇浸泡5 min;更换85%乙醇浸泡5 min;更换75%乙醇浸泡5 min;更换50%乙醇浸泡5 min;更换30%乙醇浸泡5 min;PBS 5 min;
good◈goo2.(2)抗原修复(选做):如果同时需要进行目的蛋白的免疫组化染色,可以使用适当的抗原修复液进行抗原修复处理。
good◈goo2.(2)注:如果使用蛋白酶K或胰酶进行抗原修复,必须反复洗涤干净,否则残留的酶会严重干扰后续标记反应。
good◈goo2.(3)转至步骤 EdU检测。
good◈ EdU检测
good◈ 在以下操作中,6孔板每孔的反应体系为500 µL反应混合物。对于12、24、48、96和384孔板,每孔的反应体系可分别调整为200 µL、100 µL、70 µL、50 µL和20 µL反应混合物。对于较小的孔,单位培养面积的液体用量已经适当增加,以有效避免液体蒸发可能带来的负面影响。对于切片,可以根据切片大小,每个切片使用100~200 µL的反应混合物。
good◈ 如下步骤以6孔板中细胞样品为例,对于其它孔板或切片样品,仅需要按比例调整每步溶液的用量,其余步骤相同。
good◈ 注:◎ 6孔板每孔的反应体系为500 µL反应混合物,对于12、24、48、96和384孔板,每孔的反应体系则可分别调整为200 µL、100 µL、70 µL、50 µL和20 µL反应混合物;
good◈ 注:◎ 对于较小的培养板孔,单位培养面积的液体用量已经进行过适当增加,可以有效避免液体蒸发可能带来的负面影响;
good◈ 注:◎ 如果是切片样本,可以根据其大小,每个切片使用100~200 µL反应混合物。
good◈goo1. 配制Click Additive Solution:对于CX004,用1.5 mL去离子水溶解一管Click Additive,混匀至全部溶解,即为Click Additive Solution;对于CX004L,加入12 mL去离子水溶解试剂盒所提供的一瓶Click Additive,混匀至全部溶解,即为Click Additive Solution。配制完成后可以分装保存于-20℃。
good◈goo2. 参考下表配制Click反应液。
good◈goo2. 注:◎ 请严格按照下表中组分顺序和体积配制Click反应液,否则点击反应可能无法有效进行;
good◈goo2. 注:◎ Click反应液须在配制后15 min内使用。
组分 | 6孔板样品数 | ||||||
1 | 2 | 4 | 5 | 10 | 25 | 50 | |
Click Reaction Buffer | 430 μL | 860 μL | 1.72 mL | 2.15 mL | 4.3 mL | 10.75 mL | 21.5 mL |
CuSO4 | 20 μL | 40 μL | 80 μL | 100 μL | 200 μL | 500 μL | 1 mL |
647 Azide | 1 μL | 2 μL | 4 μL | 5 μL | 10 μL | 25 μL | 50 μL |
Click Additive Solution | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 250 μL | 500 μL | 1.25 mL | 2.5 mL |
总体积 | 500 μL | 1 mL | 2 mL | 2.5 mL | 5 mL | 12.5 mL | 25 mL |
good◈goo3. 去除上一步骤中的洗涤液;
good◈goo4. 每孔加入0.5 mL Click反应液 ,轻轻摇晃细胞培养板以确保反应混合物将样品均匀覆盖;
good◈goo5. 室温避光孵育30 min,也可酌情适当延长孵育时间;
good◈goo6. 吸除 Click反应液 ,用 洗涤液 洗涤3次,每次3~5 min;
good◈goo7. 如果需要对细胞核进行染色,可以参照步骤 细胞核染色 进行。如无其它的特殊需求,即可在能检测远红外荧光的荧光显微镜下观察,或使用有相应激发和发射检测模块的流式细胞仪、多功能酶标仪等进行荧光检测
。647 Azide的最大激发波长是650 nm,最大发射波长是670 nm;
good◈ 细胞核染色
good◈ 为了检测细胞增殖比例,可以使用Hoechst 33342进行细胞核染色。此外,高内涵筛选仪器一般也需要对细胞核进行染色。
good◈goo1. 1×Hoechst 33342溶液的配制:按1:1000比例用1×PBS(货号:PS110)稀释Hoechst 33342(1000×);
good◈goo2. 接 EdU检测 步骤6,吸除 洗涤液 后,每孔加1×Hoechst 33342溶液1 mL,室温避光孵育10 min;
good◈goo3. 吸除1×Hoechst 33342溶液,用 洗涤液 洗涤3次,每次3~5 min;
good◈goo4. 进行荧光检测。Hoechst 33342为蓝色荧光,最大激发波长为346 nm,最大发射波长为460 nm;
good◈ 流式细胞仪检测
good◈ 对于经步骤 EdU检测 或 细胞核染色 获得的细胞悬液样品进行流式检测。如果使用传统的流体动力学聚焦的流式细胞仪来测量总DNA含量,请在检测过程中使用低流速,实验中的每个样品应使用相同的收集速率和细胞浓度。EdU标记产生的荧光信号一般使用对数刻度的横坐标。647 Azide的最大激发波长是650 nm,最大发射波长是670 nm。
good◈goo2. 注:◎ 建议使用未经EdU标记的细胞样品作为流式细胞仪检测的阴性对照,并选择合适的电压;
good◈goo2. 注:◎ 由于流式细胞仪检测比较灵敏,可根据细胞类型和实际染色情况对647 Azide的使用量进行适当调整。
注意事项
good1. Click Additive配制成溶液后请注意适当分装。如溶解后有白色物质析出,请上下颠倒数次,待其全部溶解后使用。如果该溶液颜色变成棕色,则说明已失效,请弃用;
good2. 本产品完全兼容多种有机染料,如Alexa Fluor®系列普通染料、fluorescein(FITC)、Allophycocyanin(APC)及APCE-tandems染料;对于Qdot®纳米晶体探针、Horseradish peroxidase(HRP)、R-phycoerythrin(R-PE)和R-PE-tandems染料如Alexa Fluor®680-R-PE等,需在点击反应完成后进行反应和检测;
good3. 本产品会影响GFP、RFP、mCherry等荧光蛋白的荧光,对于荧光类蛋白如Green Fluorescent Protein(GFP)、TC-FlAsH™和TC-ReAsH™类试剂,需在点击反应前进行反应和检测。由于Phalloidin (鬼笔环肽)不兼容点击反应,推荐使用Tubulin-Tracker Red进行细胞微管的检测;
good4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作;
good5. 本产品仅限科研使用。
风险提示:丁香通仅作为第三方平台,为商家信息发布提供平台空间。用户咨询产品时请注意保护个人信息及财产安全,合理判断,谨慎选购商品,商家和用户对交易行为负责。对于医疗器械类产品,请先查证核实企业经营资质和医疗器械产品注册证情况。
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CX004【21E31】EdU-647细胞增殖检测试剂盒.pdf 附 (下载 0 次)