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UniSil®反相色谱硅胶填料粒径高度均一、孔径分布集中,机械强度高,键合密度高,封端良好,因此具有出色的物理和化学性能,具体表现在容易装柱、柱效高、分辨率好、背压低和pH耐受范围宽,键合相脱落少,最终体现出色谱纯化工艺载量高、选择性好、分离度好、效率高、寿命长、纯化成本低等优点。
纳微科技UniSil®反相色谱硅胶填料产品种类齐全,可以满足实验室分析型高效液相色谱(UPLC、HPLC)分析和工业制备高效液相色谱(Prep-HPLC)的各种需求,已广泛应用于各种有机化合物、天然产物、发酵及半合成抗生素和蛋白大分子的色谱分析和工业化生产。
纳微科技反相色谱硅胶填料按照表面修饰形式,可提供包含C1、C4、C8、C18、C18 AQ、C18 Polar、C30、Phenyl等多种功能基团类型的UniSil®反相色谱硅胶填料,以满足不同类型混合物样品的反相色谱分析和制备分离纯化,并可为特殊应用领域提供产品定制。
纯化操作步骤
层析柱装填(推荐动态轴向压缩柱装柱法)
匀浆液的浓度是指填料沉降至体积恒定后的体 积比上匀浆液的总体积。为了取得最佳的装柱效果, 我们推荐异丙醇为匀浆溶剂,匀浆液浓度为 50~60 %。 匀浆液的浓度可以按照如下方法配制:
1)首先计算所装色谱柱的柱体积 Vc* ,然后计算该体 积所需填料的质量 m,
按照下列公式计算:
*Vc:色谱柱柱体积;h:色谱柱高度;r:色谱柱半径;ρ: 填料堆积密度。为获得紧密的柱床,推荐填料的质量过量, 一般为所需填料 m 的 1.05~1.10 倍。
为获得紧密的柱床,推荐填料的质量过量, 一般为所需填料 m 的 1.05~1.10 倍。
2)准备好色谱柱,总的柱体积应该足够把匀浆液一 次倒入。
3)使用洗瓶或倒流的方法将色谱柱底部的筛板用 匀浆液溶剂润湿,并关掉色谱柱出液口阀门,在色谱 柱底部保留 1~2 cm 高的液体。
4)重新搅动匀浆液,确保其分散均匀。
5)把匀浆液慢慢的倒入色谱柱中,防止混入气体。 6)待匀浆液完全转移到色谱柱,用装有匀浆液溶剂 的洗瓶冲洗色谱柱内壁。 7)对于粒径 10 μm 的硅胶填料推荐设定 80~100 Bar 的压力,对于 20~40 μm 的硅胶填料推荐设定 40~70 Bar 的压力,来装填动态轴向压缩柱。
柱效评价 通常在使用色谱填料之前,均会进行色谱柱性能 测试,并保存测试结果,以作为评价今后色谱性能变 化的重要参考。对于 UniSil®系列反相色谱填料柱, 我们推荐采用的流动相为甲醇,将甲苯的柱效、对称 因子及保留时间定为色谱性能参考指标,但要注意测 试前用流动相平衡硅胶色谱柱 4~5 倍柱体积。具体 测试参数详见下表:
关于流动相的选择
纳微科技反相硅胶填料可以使用异丙醇、甲醇、 乙醇、乙和四氢呋喃等有机溶剂,也可以使用 TFA 等离子对试剂来改善分离效果。 对于非耐水反相填料而言,由于填料表面键合了 强疏水性的基团,因此不宜设定流动相为 100 %的水 相。且若流动相中有机相比例低于 10 %,则不宜长 时间运行。注意在使用后务必应用有机相比例大于50 %的流动相进行清洗保存。
清洗 色谱填料经过长时间的使用后,可能会因为样品 中一些强保留物质累积吸附在填料表面难以被洗脱, 这会严重影响色谱填料的性能和后期的填料应用效 果。为了对色谱填料进行清洗(可在线清洗,也可转 移到容器中处理),特此推荐使用极性更低的流动相 进行反复洗脱,如可选用纯乙菁、甲醇或 95% :5% 的二-氯甲烷与甲醇的混合溶液。若上述清洗方法效果 不佳,可采用极端方法即二甲亚砜或二甲基甲酰胺在 低流速下洗脱,注意在切换使用不同极性溶剂清洗时, 应使用与上次清洗溶剂互溶的溶剂冲洗置换一下填 料的液体环境,如异丙醇。
再生
色谱柱在经过长期使用之后,往往会出现柱效下 降(柱子的理论塔板数降低)的情况,此时可对色谱 填料柱进行再生操作,一般将一个冲洗流程确定为 10 倍柱体积。 反相硅胶填料可用一系列非极性逐渐增强的溶 剂清洗色谱柱,比如乙菁(甲醇)→异丙醇→二氯甲 烷,然后再按相反地顺序换回原来的流动相。
储存
填料长期保存:填料应清洗干净并进行充分干燥, 使用密封性能好的袋子或者桶装好,在阴凉干燥处密 封保存,保质期为 5 年。 填料短期保存:在乙菁或甲醇中保存。
产品属性
故障排除
纳微科技的硅胶色谱填料可以耐受多次装柱和拆卸:拆卸时,将一个足够大的容器放在柱底部,打开 柱底塞,放出浆液,用容器收集浆液,或移走柱顶部 的液体分配器,向层析柱中加入足够量的流动相,轻 轻搅拌使得柱内填料成浆液,悬浮的浆液可以用虹吸 管抽至合适的容器中。另有两个事项需要注意:任何 进入色谱柱的溶液均要经过 0.45 µm 滤膜过滤;任何 时候都不要用硝酸来清洗纳微科技的色谱填料产品。 具体请参考下表:
1、柱压升高
原因分析 | 建议措施 |
流速过高 | 降低流速 |
泵和收集器之间的阀门未打开 | 打开阀门 |
仪器在线过滤器堵塞 | 拆 掉 过 滤 器 并 清 洗,可能的话替换 过滤器;在使用前 过滤样品和洗脱液 |
柱前堵塞 | 使用 20 BV 流动相 反冲色谱柱 |
部分样品或杂质未清洗干净 | 执行清洗操作 |
样品在柱子上发生沉淀 | 遵循清洗步骤,调 节洗脱液来维持样 品 |
溶解度 柱床被压缩 | 重新装填柱子 |
色谱柱使用时间过长 | 更换色谱柱或更换色谱填料 |
使用 pH 超出正常范围 | 清洗后若柱压无法 恢复则建议更换色 谱柱或色谱填料 |
2、样品在梯度洗脱前被洗脱
原因分析 | 建议措施 |
样品溶液中离子强度太高 | 降低样品溶液的离子强度, 如采用稀释或脱盐等手段 |
pH 不合适 | 调节 pH 增加结合强度 |
随着上样次数的增加, 部分样品或杂质未清 洗干净 | 执行清洗操作 |
3、样品在洗脱过程中不被洗脱
原因分析 | 建议措施 |
洗脱液的离子强度过低 | 增加洗脱液的浓度 |
洗脱液的洗脱能力过低 | 更换洗脱能力更强的洗脱液 |
洗脱液的 pH 不合适 | 调整洗脱液的 pH |
4、分辨率降低
原因分析 | 建议措施 |
不合适的洗脱条件,如 梯度过陡或流速过高 |
改变洗脱条件,采用较缓的梯 度洗脱或等度洗脱,降低流检查柱效 |
柱子未装填好 | 检查柱效,重新装柱速 |
在柱子顶端或柱后有大 部分的混合空间 | 加高填料的上表面或减少柱 子后体积 |
柱子过载 | 清洗并重新平衡色谱柱,降低 上样量 |
部分样品或杂质未清洗 干净 | 执行清洗操作 |
粒径较大 | 更换同种类型粒径更小的填 料 |
选择性差 | 增加或调解离子对试剂或更 换其他类型填料 |
由于表面的硅烷醇导致 混合模式滞留 | 降低 pH 抑制硅烷醇或更换柱 子 |
5、柱床中有气泡
原因分析 | 建议措施 |
洗脱液没有脱气 | 将缓冲液充分脱气 |
流动相在混合后产生 气泡 | 如果可能的话,线下将流动 相混合后脱气,然后等度洗脱 |
柱子未装填好 | 重新装柱 |
6、基线漂移
原因分析 | 建议措施 |
色谱柱未平衡好 | 增加平衡时间 |
洗脱液 A,B 在同一紫 外波长下吸收系数不同 | 使用不同的波长或走空白梯 度 |
洗脱液不纯 | 使用高纯度的色谱纯级试剂 |
7、出现鬼峰
原因分析 | 建议措施 |
前一个样品的不完全洗脱 | 再生 |
洗脱液不纯 | 运行空白对照或使用高纯 度的色谱纯级试剂 |
洗脱液本身的吸收 | 运行空白对照,或更换没 有紫外吸收的洗脱液 |
痕量离子性杂质结合 在色谱柱上,在平衡和 上样过程中被浓缩,洗 脱时出峰 | 清洗色谱柱 |
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