CD9外泌体慢病毒包装

一、技术简介
外泌体特指直径在30-150nm的囊泡，其主要来源于细胞内多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族（CD63, CD81 和CD9）、热休克蛋白家族（HSP60, HSP70和HSP90），本示踪病毒使用CD9作为生物标记，通过将CD9与荧光蛋白偶联，带荧光的膜蛋白会在表达至外泌体膜上，便于后续进行、观察内化或其他实验。
慢病毒包装是慢病毒（Lentivirus）载体的构建过程重要的一环。慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1（H IV-1）来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。
慢病毒属于逆转录病毒科，但其基因组结构复杂，除 gag、pol和env这3个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外，还包括4个辅助基因，vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev。HIV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒，第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。慢病毒载体的构建原理就是将HIV 21基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由HIV 21基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的HIV 21顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒(RCV)的可能性，将包装成分的5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子，3′LTR换成 SV 40 polyA 位点等。将包装成分分别构建在两个质粒上，即一个表达gag和pol、另一个表达env。

二、实验流程
1. 构建含有CD9外源基因的重组载体。
2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒。
3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染293T细胞，进行病毒包装和生产，收集病毒液。
4. 浓缩、纯化病毒液。

三、服务说明及结果。
1. 公司提供：CD9-RFP示踪慢病毒液（≥1×10⁸ TU/ml, 1ml）和CD9-GFP示踪慢病毒（≥5×10⁷TU/ml, 1ml），提供实验过程中所用的耗材、仪器设备和操作过程的说明清单一份。
2. 实验周期：20-30个工作日。