基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR,MSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物,如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段,则说明该位点存在甲基化;反之,说明被检测的位点不存在甲基化。 亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR,在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶,最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序,可以提高测序成功率,这种方法称为BSP-克隆测序法。 高分辨率熔解(High Resolution Melt'' HRM) 是一种最新的在表观遗传学中检测CpG位点的一种新技术。随着温度的升高,双链DNA(dsDNA)会分解为单链(ssDNA),HRM 技术就是根据PCR双链产物的分解(溶解)特性对其进行分析。在HRM 分析之前,必须扩增靶序列。应用针对亚硫酸氢盐转化后序列特异性的引物,而不是甲基化特异性引物进行亚硫酸氢盐转化后DNA 扩增。因此,引物应当包含若干转化后胞嘧啶,并应当在CpG 位点边上。以此确保只扩增亚硫酸氢盐转化后DNA,并在HRM 分析过程中区分甲基化和未甲基化CpG。 科研和临床应用 l 肿瘤的早期预测、分类分级、预后评估及多种疾病的分析。 l 转录水平分析:位于启动子区域的甲基化一般会抑制转录。 l 细胞凋亡等调控机制的研究。 操作流程:
提取高质量DNA
采用Qiagen Epitect Bisulfite Kit进行亚硫酸氢盐修饰
以修饰后的DNA做为PCR模板,进行MSP、BSP、HRM等分析
标本采集、保存、运输 l DNA样品,如需长途运输,可将检测合格的样品编号密封,注意切勿泄漏,冷冻运输。 l 组织和细胞样品,采样后立即用液氮速冻,于-80℃保存,冷冻运输。 l 血液样品:新鲜全血EDTA抗凝或枸椽酸钠抗凝,2-8℃48 h内运送到实验室,如不能立即运送,样品采集后于-20℃或-80℃保存,冷冻运输。 客户须知 l 细胞(≥1×IOn个)、组织(≥300 mg)、血液(≥1 ml)、血清(≥1.5 ml)等样品,基因组DNA(体积≥20川,;农度≥50 rigMI,用ddH20溶解DNA)。 l 客户需提供检测目的基因的名称、序列或者Genbank序列号。 达晖提供 报告单包括:详细的实验报告(仪器、试剂、引物序列、实验流程、甲基化程度分析等),检测方法、检测结果(MSP电泳图片、BSP测序结果或HRM熔解曲线)、检测结果解释(检测区域是否发生甲基化),举例如下: 检测方法:MSP法 检测结果:2%琼脂糖凝胶电泳图