(Li et al. (2017) Cancer Cell, 31(1):127-141) 如上图所示,在急性髓细胞白血病AML中,FTO存在表达量显著上升现象。作者在AML细胞系中,对FTO这个基因进行敲低和过表达后发现AML细胞m6A整体水平降低,凋亡减少。敲低FTO趋势相反。 (3)甲基化酶敲低和过表达动物模型实验
(Ma J et al. (2017) Hepatology, 62(2): 529) 动物模型通常为可选项,可以根据自己的经费和实验整体设计来安排。如上图所示,作者在小鼠肿瘤模型中对METTL14进行敲低后发现肝癌转移能力增强。 2、m6A-seq挖掘靶基因
(Lence et al. (2016) Nature, 540(7632):242-247) 通过m6A-seq测序,可以知道究竟哪些基因在RNA甲基化修饰上有差异。如上图所示,作者对果蝇SR2+细胞进行m6A-seq和转录组测序后发现,差异基因都富集在神经功能上。
(Li et al. (2017) Cancer Cell, 31(1):127-141) 如果最后的差异基因或者存在甲基化修饰差异的基因过多怎么办? 可以结合自己先前课题的研究,在这些差异基因中寻找是否包含原有已知的通路和基因。如上图所示,通过m6A-seq作者在AML发现了几百个差异基因。初步筛选一般包括功能富集分析等方法。当几百个基因被限定到11个差异基因时,作者从中发现了RARA和ASB2这2个抑制白血病细胞生长的基因与全反式维甲酸相关。先前研究表明全反式维甲酸治疗后ASB2和RARA显著上调。这样子,在一大堆候选基因中,范围继续缩小。 3、靶基因细胞实验
(Li et al. (2017) Cancer Cell, 31(1):127-141) 如上图所示,在确定ASB2和RARA为去甲基化酶FTO的靶基因后,除了常规的qPCR+WB验证外,作者还进行了补救实验(rescue)以及m6A-IP-qPCR(也叫MeRIP-qPCR)。作者用细胞实验对ASB2和RARA进行敲低并发现AML细胞表型与FTO过表达相似,表型被补救。
参考文献: [1] Pan Y, Ma P, Liu Y, et al. Multiple functions of m 6 A RNA methylation in cancer[J]. Journal of Hematology & Oncology, 2018, 11(1):48.IF=6.35 [2] Li Z, Weng H, Su R, et al. FTO Plays an Oncogenic Role in Acute Myeloid Leukemia as a N6-Methyladenosine RNA Demethylase[J]. Cancer Cell, 2016, 31(1):127.IF=27.407 [3] Zhang S, Zhao B S, Zhou A, et al. m 6 A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program[J]. Cancer Cell, 2017, 31(4):591.IF=27.407 [4] Su R, Dong L, Li C, et al. R-2HG Exhibits Anti-tumor Activity by Targeting FTO/m6A/MYC/CEBPA Signaling[J]. Cell, 2017, 172(1-2):90-105. IF=30.4 [5] Meyer, K., & Jaffrey, S. R. (2017). Rethinking m6A Readers, Writers, and Erasers. Annual Review of Cell & Developmental Biology, 33(1), 319. [6] Fu, Y., Dan, D., Rechavi, G., & He, C. (2014). Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics, 15(5), 293-306. [7] Roundtree, I. A., Evans, M. E., Pan, T., & He, C. (2017). Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation. Cell, 169(7), 1187.