细胞焦亡（pyroptosis

一、细胞焦亡介绍
    细胞焦亡（pyroptosis）是一种最近发现的细胞程序性死亡方式，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。自2015年以来，邵峰院士等人发现，caspase-1和caspase-11/4/5是通过切割一个叫做Gasdermin-D（GSDMD）的蛋白而诱发细胞焦亡的，GSDMD在被caspase-1或caspase-11/4/5切割后，释放出其N端结构域，该结构域具有结合膜脂并在细胞膜上打孔的活性，这样就导致细胞渗透压的变化而发生胀大直至最终细胞膜的破裂（Shi et al., Nature 2015；Ding et al., Nature 2016）。细胞焦亡是机体重要天然免疫反应，在拮抗感染和内源危险信号中发挥重要作用。细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展，对细胞焦亡的深入研究有助于认识其在相关疾病发生发展和转归中的作用，为临床防治提供新思路。近几年，细胞焦亡的研究热度迅猛上升，已成功吸引科学家们的眼球，一跃成为热门研究领域。
细胞焦亡（pyroptosis）、细胞凋亡（apoptosis）、细胞自噬（autophagy）、细胞坏死性凋亡(necroptosis)都是程序性死亡（Programmed Cell Death, PCD）的表现形式，程序性细胞死亡是指细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后，为了维持内环境稳定而发生的一种主动性消亡过程。细胞凋亡由凋亡性caspase（Caspase-2, 3, 6, 7, 8, 9或人类caspase-10）介导。与细胞凋亡相比，细胞焦亡是由炎症性caspase（Caspase-1, 4, 5, 11）诱导的一类坏死性和炎症性的细胞程序性死亡。相比于细胞凋亡，细胞焦亡发生的更快，并会伴随着大量促炎症因子的释放。由于细胞焦亡需要炎症性caspase的参与，其与另一种坏死性和炎症性的细胞程序性死亡方式—坏死性凋亡不一样，坏死性凋亡发生不需要caspase的参与。
细胞焦亡与其它程序性死亡和非程序性死亡的差异

                      细胞焦亡（pyroptosis）

              细胞凋亡（apoptosis）

图1. Chen X , He W T , Hu L , et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis[J]. Cell Research, 2016, 26(9):1007-1020.

二、细胞焦亡的特点
    细胞焦亡发生时，细胞会发生肿胀，在细胞破裂之前，细胞上形成凸出物（图1，细胞焦亡Early），之后细胞膜上形成孔隙，使细胞膜失去完整性，释放内容物，引起炎症反应，此时，细胞核位于细胞中央（图1，细胞焦亡Late），随着形态学的改变，细胞核固缩，DNA断裂。
细胞焦亡过程，具有caspase-1依赖性。在外界条件的刺激下，caspase-1前体可以与模式识别受体NLRP1、NLRP3等通过接头蛋白ASC变为一个高分子复合物，即炎症小体，也称依赖caspase-1的炎症小体。细胞在caspase-1激活同时会释放出炎性因子白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）和IL-18，进而吸引更多的炎性细胞，加重炎症反应。
焦亡发生时形成孔隙，它允许细胞质的内容物，如乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）和炎性细胞因子释放，荧光标记的膜联蛋白V、7-氨基放线菌D或碘化丙啶进入细胞。
三、细胞焦亡的信号通路
细胞焦亡属于炎症性死亡途径，按激活机制，可分为Caspase-1依赖和不依赖两种途径。两种途径都是通过切割GSDMD后形成N端游离的肽段，这一肽段会诱导细胞形成孔道并导致细胞破裂，释放胞质成分。两种途径都能同时诱导IL-1β和IL-18的前体进行切割，形成成熟的IL-1β和IL-18。不同的只是是否直接激活Caspase-1。

                        细胞焦亡的机制

  炎性小体激活的分子机制与焦亡的诱导发生需要两步机制：第一步是启动步骤，促炎因子如 proIL-1β、Nlrp3和caspase-11等的转录生成。第二步是激活炎性复合物，炎性复合物包括NLR（NOD-like receptors，胞浆内感受器）蛋白家族成员、衔接蛋白ASC/TMS1和Pro-Caspase-1，其中NLR蛋白家族成员中NLRP3是细胞焦亡中的主要炎性复合物。
（1）细胞焦亡发生的经典通路：在病原体、细菌等信号的刺激下，细胞内的NLR识别这些信号，通过衔接蛋白ASC与Pro-Caspase-1结合，激活Caspase-1，活化的Caspase-1一方面切割GasderminD，形成GasderminD氮端和碳端，GasderminD氮端就会和细胞膜上的磷脂蛋白结合，形成孔洞，释放内容物，诱导焦亡发生；另一方面，活化的Caspase-1对IL-1β和IL-18的前体进行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并释放到胞外，造成炎症反应；
（2）依赖Caspase-4、5、11的非经典途径：以炎性刺激因子LPS为例，没有通过受体直接进入细胞质内，Caspase 其它家族成员如Caspase-4、5、11被活化，活化的Caspase-4、5、11切割GasderminD，诱导焦亡发生；另一方面，诱导Caspase-1的活化，对IL-1β和IL-18的前体进行切割，造成炎症反应。
四、细胞焦亡的研究方法
    细胞焦亡的机制中GSDMD的切割，IL-1β和IL-18前体的切割成熟和释放是关键信号，因此证明所诱发的细胞死亡方式是否为细胞焦亡，需要几个关键的实验证据：
（1） GSDMD的切割 （Western检测）；
（2） Caspase的激活，主要是Caspase-1，Caspase-4，Caspase-5，Caspase-11。（Western检测）；
（3） IL-1β和IL-18前体的切割成熟和释放 （Western，ELISA等）；
（4）细胞形态学检测（CCK-8等）；
（5）染色质完整性检测 （Tunel等）。
完整检测方式如下：
1、形态变化
（1）扫描电镜观察细胞形态；
（2）免疫荧光染色（GSDMD/GSDME）；
（3）Tunel检测。
2、检测焦亡相关基因及蛋白
（1）q-PCR/Western Blot方法检测焦亡相关基因或蛋白的表达水平（例如，Caspase-1、4、5、11；GSDMD；Cleaved Caspase-3、IL-1β、IL-18、NLRP3、ASC等）；

（2）ELISA试剂盒检测炎症因子的水平；
（3）CCK8法测定细胞活力；
（4）免疫组化检测组织蛋白的表达。
五、细胞焦亡相关的研究领域
细胞焦亡是机体重要的免疫反应，在拮抗感染和内源性危险信号中发挥重要作用。广泛参与肿瘤、感染性疾病、代谢性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展。
1、细胞焦亡与感染性疾病
在病原体感染时，适度的细胞焦亡可清除致病微生物，而过度的细胞焦亡在导致细胞死亡的同时，释放炎症因子，扩大炎症反应，造成发热，低血压、败血症等症状。以败血症为例，败血症是由致病菌侵入血液系统，并在其中生长繁殖，产生毒素，引起全身性感染，zuixin研究表明，细胞自噬相关基因Atg7沉默后，可激活细胞焦亡途径。


2、细胞焦亡与代谢性疾病或心血管疾病
（1）因代谢障碍或代谢旺盛等原因引起的疾病称为代谢性疾病，常见的有糖尿病、痛风、糖尿病性心肌病等。以糖尿病性心肌病为例，由心肌细胞死亡引起，zuixin的研究显示高血糖可以造成活性氧的产生增加，进而上调NF-κB和TXNIP，NF-κB又可以上调NLRP3、IL-1β前体以及IL-18前体的表达；TXNIP通过改变NLRP3的结构激活Caspase-1，活化的Caspase-1一方面切割Gasdermin D，形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段，诱导心肌细胞膜穿孔、破裂，释放内容物，引起炎症反应；另一方面，活化的Caspase-1对IL-1β和IL-18的前体进行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并释放到胞外，募集炎症细胞聚集，扩大炎症反应。


（2）通过小鼠心肌炎动物模型研究发现， 1, 25-二羟基维生素D3能够抑制心肌细胞焦亡信号通路阻止心肌细胞死亡，使1, 25-二羟基维生素D3治疗后的心肌炎小鼠病情状况普遍得以改善。Cholecalciterol cholesterolemulsion attenuates experimental autoimmune myocarditis in mice via inhibitionof the pyroptosis signaling pathway.
（3）研究发现，高血糖环境下miRNA-9可通过作用于蛋白ELAVL1 (ELAV-like protein 1) ，继而抑制caspase-1及IL-1β在心脏及心肌细胞中的表达，阻遏高糖诱导的心肌细胞焦亡，这为糖尿病心肌病提供了可能的治疗靶点。

3、细胞焦亡与神经系统疾病
神经系统疾病包括脑损伤，癫痫等。以癫痫为例，研究发现，癫痫发作可通过钾离子外流等途径激活NLRP1炎症体，进而激活依赖Caspase-1的焦亡途径，导致癫痫进一步发展。


4、细胞焦亡与动脉粥样硬化
（1）在动脉粥样硬化的发展中，炎症被认为是启动和驱动动脉粥样硬化的主要因素。在高血脂、氧化修饰的低密度脂蛋白等几次下，激活Caspase-1，介导血管内皮细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞的焦亡与炎症反应，导致血管扩张功能障碍、坏死中心的形成，粥样硬化斑块的稳定，最终造成动脉粥样硬化。


（2）研究发现NLRP3相关的下游分子 (ASC、caspase-1、IL-1β及IL-18) 在动脉粥样硬化斑块中的表达明显高于非动脉粥样硬化血管，且其表达的上调与斑块的脆性密切相关，提示NLRP3炎性小体激活介导动脉粥样硬化病变的演进。NLRP3 Inflammasome Expressionand Activation in Human Atherosclerosis.
5、细胞焦亡与肿瘤
（1）研究发现，在ROS及细胞毒素的作用下，JNK激酶被激活并转移到细胞核内，促进焦亡相关基因的表达，启动焦亡的形成，控制肿瘤的发展。

（2）一项采用5-氟尿嘧啶处理胃癌细胞系以探索胃癌化疗机制的研究发现，gasdermin家族中的GSDME能将化疗药物诱导的caspase-3依赖的细胞凋亡转换胃癌细胞焦亡，进而达到治疗目的。GSDME mediatescaspase-3-dependent pyroptosis in gastric cancer.
6、细胞焦亡与肾相关疾病
（1）研究发现，长链非编码RNA MALAT1 参与了糖尿病肾病肾小管上皮细胞的焦亡过程。MALAT1 抑制了 mir-23c 的表达，mir-23c 的下调促进了其靶基因 ELAVL1 的表达，ELAVL1 是一种细胞焦亡相关蛋白，ELAVL1 表达增加后可促进下游 NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-1 的生成，最终导致肾脏炎症反应和细胞焦亡。Long noncodingRNA MALAT1 regulates renal tubular epithelial pyroptosis by modulated miR-23ctargeting of ELAVL1 in diabetic nephropathy.
（2）近年来研究发现，细胞焦亡同样参与了肾脏纤维化的发生发展。研究发现 NLRP3 基因敲除的 UUO 小鼠与野生型相比，其活化的 Casapse-1/IL-18/IL-1β明显减少，且肾小球的损伤及小管间质纤维化明显减轻。NLRP3 deficiency attenuatesrenal fibrosis and ameliorates mitochondrial dysfunction in a mouse unilateralureteral obstruction model of chronic kidney disease.
（3）晶体相关性肾病研究发现以含 100 μg/mL尿酸培养液培养肾小管上皮细胞发现 TLR4、NLRP3、Caspase-1、IL-1β 表达的增加，予以 TLR4 的阻滞剂TAK242 干预后 NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达明显减少，说明尿酸可通过 TLR4 激活 NLRP3 及下游焦亡信号因子，导致肾脏炎症反应及细胞焦亡。

Soluble uric acid increases NALP3 inflammasome and interleukin-1β expression in human primary renal proximaltubule epithelial cells through the Toll-like receptor 4-mediated pathway.
7、细胞焦亡与lncRNA
最近的研究表明，lncRNA在调节细胞焦亡中具有重要作用， 通过直接或间接作用于与细胞焦亡信号通路相关的蛋白质，lncRNA参与了与心血管疾病，肾脏疾病，免疫疾病和其他疾病有关的病理过程。

                Long non-coding RNAs and pyroptosis.

8、重磅研究进展 
（1）Science：ESCRT膜修复系统是细胞焦亡过程的补救机制
2018年11月23日，Science发表了一篇细胞焦亡机制相关的重要研究论文，报道细胞发生焦亡激活的时候，胞内钙离子流会因为GSDMD孔道而发生变化，细胞以此为信号，募集ESCRT复合物进行损伤膜系统的修复。抑制ESCRT-III可显著提高细胞焦亡的比例。本文的报道发现了一种内源的细胞焦亡过程中的补救机制，是细胞焦亡机制的重要进展。

（2）Nature：化疗药物通过Caspase-3切割GSDME诱导细胞焦亡
2017年5月1日，Nature发表了邵峰的一项重要研究成果，报道发现化疗药物诱导Caspase-3切割GSDME，实现细胞凋亡向细胞焦亡的转变。被Caspase-3切割后的GSDME的N端多肽也可以形成孔道，最终导致炎症性细胞因子的释放。GSDME在正常组织中有一定的表达水平，但经常在肿瘤细胞中表达沉默。GSDME敲除小鼠对一些化疗药物（如顺铂）诱发的组织损伤具有一定的抵抗能力。本文的工作首次发现了细胞凋亡的执行者Caspase-3切割GSDMD同家族的另一成员GSDME，可以实现细胞凋亡-细胞焦亡的转变。