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96T/48T
人白细胞介素17定量分析酶联免疫检测试剂盒
本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的IL-17浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整,。如有产品包装破损或质量投拆,请在收到货一个月之内联系我们。
IL-17简介:
白介17,是一类新的细胞因子家族,一般是由一个二硫键连接的同型二聚体。每个肽链含有155个氨基酸残基,分子量约为17.5kDa。白介17家族共有六个成员,其中具同型二聚体结构,分子量约为32kDa的白介17A主要由活化的T记忆细胞产生,刺激机体的免疫。
许多证据都表明IL-17具有调控免疫反应的功能。IL-17调控T细胞造血系统细胞间的通讯已被证明。T细胞产生的IL-17通过NF-κB通路的作用,诱导成纤维细胞产生IL-17, IL-8, ICAM-1 和G-CSF等细胞因子。IL-17也可通过刺激T细胞来提高T细胞本身的扩增和提高在骨关节炎患者软骨中NO水平的增高。
最近的研究表明,IL-17家族的细胞因子在炎症性疾病、自身免疫病和肿瘤等发生中均有重要的作用。几种如气管炎、类风湿性关节炎、腹膜炎引起的粘连和脓肿、肠炎、异体移植、牛皮癣、肿瘤和几种硬皮病等疾病中都检测出IL-17表达水平的提高。IL-17调节通路在关节软骨、骨、半月板、脑、造血组织、肾、肺、皮肤和肠中都起着重要的作用,表明IL-17在这类组织中不仅是免疫作用,而且在该类组织的正常和病态的平衡间扮演一个重要的作用。
检测原理:
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-17的浓度。IL-17捕获抗体已预包被于酶标板上,当加入标本或参考品时,其中的IL-17会与捕获抗体结合,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人IL-17抗体后,抗人IL-17抗体与IL-17接合,形成夹心的免疫复合物,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合,亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来;其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂,若样本中存在IL-17将会形成免疫复合物,辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质,在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测,读其450nm处的OD值,IL-17浓度与OD450值之间呈正比,通过参考品绘制标准曲线,对照未知样本中OD值,即可算出标本中IL-17浓度。
人IL-17定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:
组分 |
规格(96T/48T) |
人IL-17预包被板 |
12条/6条 |
样本分析缓冲液 |
5ml/3ml |
标准品稀释液 |
10ml/5ml |
人IL-17标准品 |
2支/1支(冻干) |
人IL-17生物素化抗体 |
10ml/5ml |
亲和素连接的HRP酶 |
10ml/5ml |
浓缩洗涤液 20× |
30ml/15ml |
TMB底物 |
10ml/5ml |
中止液 |
5ml/3ml |
封板胶纸 |
3/2张 |
说明书 |
1份 |
标本收集:
1.标本的收集请按下列流程进行操作;
A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可;
B.血清标本应是自然凝固后,取上清,避免在冰箱中凝固血液;
C.血浆标本,推荐用EDTA的方法收集;
D.标本收集后请分装,若待测样本不能及时检测,冻存于-20℃,避免反复冻融。
2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂;
3.标本应清澈透明,检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。
4.请勿使用溶血,高血脂或污染的标本检测,否则结果将不准确。
注:人血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。
注意事项:
1.试剂盒请保存在2~8℃。
2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶,请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。
3.标准品复溶加样后,剩余部份请丢弃。
4.底物请勿接触氧化剂和金属。
5.加样时,请及时更换枪头,避免交叉污染。
6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。
7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要,在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。
8.室温反应,请严格控制在25-28℃。
9.洗涤过程是至关重要的,洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。
10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。
11.加样过程中避免气泡的产生。
12.血清和血浆标本的检测时,检测抗体的孵育时间应适当延长
检测前准备工作:
1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温(25~28℃)平衡20分钟;每次检测后剩余试剂请及时于2~8℃保存。
2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。
3. 如有5×标准品稀释液用双蒸水或去离子水稀释(1份加4份水)。
4.标准品:按标签复溶体积用标准品稀释液复溶使IL-17终浓度达到1000pg/ml,室温反应,请严格控制在25~28℃,静置15~20分钟后轻轻混悬(建议抽吸几次)待彻底溶解,此溶液作为标准曲线最高浓度加入,其它梯度用标准品稀释液倍比梯度稀释此溶液后依次加入检测孔中。(标准曲线取七个点,最高浓度为1000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度。)
洗涤方法:
自动洗板机或人工洗板:每孔洗涤液为300ul,注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。
实验过程需自备的材料:
1.不同规格的加样枪及相应的枪头;
2.酶标仪;
3.自动洗板机;
4.去离子水或双蒸水;
操作步骤:
1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数,取出所需板条放置在框架内,暂时用不到板条请放回铝箔袋密封,保存于4℃。
2.建议设置本底较正孔,即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。
3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中,用封板胶纸封住反应孔,室温(25~28℃)孵育120分钟。对于血清或血浆标本,请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本,如稀释量大,请将样本与样本分析缓冲液等量加入,不足部分用标准品稀释液补充至100ul。
4.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。
5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔,室温(25~28℃)孵育60分钟。
6.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。
7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔,避光室温(25~28℃)孵育20分钟。
8.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。
9.加入显色剂TMB100ul/孔,避光室温(25~28℃)孵育20分钟。
10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。
结果判断:
1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效,复孔的值平均后可作为测量值。
2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。
3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
4.若标本OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测,计算浓度时应乘以稀释倍数。
典型数值和参考曲线
浓度pg/ml |
典型OD值1 |
典型OD值2 |
OD平均值 |
0 |
0.0682 |
0.0774 |
0.0728 |
31.25 |
0.2882 |
0.3054 |
0.2968 |
62.5 |
0.4782 |
0.4732 |
0.4757 |
125 |
0.6805 |
0.6989 |
0.6897 |
250 |
1.0521 |
0.9983 |
1.0252 |
500 |
1.5082 |
1.5118 |
1.51 |
1000 |
1.9172 |
2.0526 |
1.9848 |
人IL-17参考标准曲线
注意:本图仅供参考,应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。
灵敏度,特异性和重复性:
1.灵敏度:多次重复结果表明,最小检出量为1.8pg/ml。
2.特异性:与人IFN-γ、 IL-10、 IL-12、IL-16、IL-17B、 IL-17C、IL-17D、IL-17F,小鼠 IL-17等没有交叉反应。
3.重复性:板内,板间变异系数均<10%.
参考文献:
1. Hymowitz, S.G. et al. (2001) EMBO J. 20:5332.
2. Chang, S. and C. Dong (2007) Cell Res. 17:435.
3. Yao, Z. et al. (2005) Immunity 3:811.
4. Romagnani, S. et al. (2009) Mol. Immunol. 47:3.
5. Cua, D.J. and C.M. Tato (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:479..
6. Hu, Y. et al. (2010) J. Immunol. 184:4307.
7. Khader, S.A. and R. Gopal (2010) Virulence 1:423.
8. Milovanovic, M. et al. (2010) J. Invest. Dermatol. 130:2621
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