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    研选线粒体和胞浆蛋白制备试剂盒 C1260

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    线粒体和胞浆蛋白制备试剂盒 C1260

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      • 货号:

        C1260-50

      • 规格:

        50T

      货号     产品名称 规格 价格
      C1260-50 线粒体和胞浆蛋白制备试剂盒  50次 560元
      C1260-100 线粒体和胞浆蛋白制备试剂盒  100次 980元

      描述:线粒体/胞浆制备试剂盒 (Mitochondria Isolation Kit)用于从组织或培养细胞中分离线粒体和细胞胞浆成分。加入分离溶液,匀浆破碎组织细胞,经过数次800g和12000g离心,在60分钟内即可分离出完整的线粒体和胞浆成分。制备的线粒体具有很高的生物学活性,可进行各种功能研究如酶学测定,更可用于Western Blot、2D-胶、线粒体蛋白或DNA提取、蛋白质组学等研究。

      严格按照说明操作,总是能制备获得高纯度线粒体。一篇方法学研究论文发现,用普利莱试剂盒制备线粒体的得率、活性、纯度优于蔗糖密度梯度离心法和Invotrogen/Pierce线粒体提取试剂盒方法。

      适用:从组织、培养细胞制备高纯度线粒体,同时分离细胞胞浆成分。

      组成:Mito Solution    100 ml for 50 次制备

                            200 ml for 100 次制备

      储存:短期4°C,中长期−20°C。

      操作步骤:

      以下所有操作均在4°C进行

      1. 组织匀浆:100~200 mg新鲜组织如肝、脑、肾、心肌等,剪为0.5cm2碎块放入小容量玻璃匀浆器内。估计组织块总体积。加入1.5 ml冰预冷的Mito Solution。用间隙严紧的研杵上下研磨组织20次。

      培养细胞匀浆:800 × g 5 min离心收集细胞。单次提取需2-5 × 107个细胞。加入1.5 ml冰预冷Mito Solution重悬细胞,将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内,用间隙严密的研杵研磨细胞30次。

      2. 将匀浆液转移到离心管中,800 × g ,4 ºC离心5 min。(胞核、膜碎片、未裂解细胞等在管底,弃去)

      3. 收集上清液并转移到新的离心管。再次800 × g 离心5 min at 4 ºC,弃沉淀。

      4. 将上清液转移到新的离心管。10,000 × g 离心10 min 4 ºC。线粒体沉淀在管底。离心后的上清含胞浆成分,可收集用于对照实验。

      5. 洗涤线粒体:加入0.2 ml Mito Solution,轻弹管底重悬线粒体沉淀;12,000 × g 离心10 min 4 ºC。弃上清,线粒体沉淀在管底。

      6. 重悬线粒体:可以用Mito Solution重悬线粒体沉淀,也可以用合适后续实验的自备缓冲液来裂解线粒体沉淀,具体用量是:约每100 mg组织提取的线粒体用50 µl,约每5 × 107个细胞提取的线粒体用100 µl。用量请根据组织或细胞类型进行微调。

      7. 裂解线粒体后,进行蛋白浓度测定。立即使用或−70 ºC保存。

       

      说明:

      1. 制备高质量线粒体的关键:第一,全程低温操作,将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中;第二,快速,微量制备比大规模制备操作更快速,更容易获得完整的线粒体,且得率高;第三,在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。破碎效果与组织细胞类型有关;与组织块相比,贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁。1-3 ml小容量玻璃匀浆器(而不是其它破碎装置)上下研磨培养细胞20-30次。玻璃匀浆器须配套选用间隙严密的研杵,其特征是将研杵插入匀浆器套管后,可提起研杵而套管不会脱落。正确的匀浆不是旋转研杵,而是上下缓慢推拉研杵,研杵推进和提升过程中细胞遭受压力的剧变而破碎。研磨程度可用相差显微镜进行检查当未裂解细胞在~50%即可。过度研磨会破坏线粒体,而研磨不足将降低线粒体得率。

      2. 如果不得不用电动匀浆器(polytron),可选用6500转,刀头上下进出4次共计10秒。不同的电动匀浆器性能差别甚大,除非步步监测,否则分离结果难以预料。

      3. 不同的离心机必须跟据离心力g计算正确的离心转速(允许10%波动),否则将导致不纯。

      4. 进行Western Blot可直接用RIPA裂解液或SDS-PAGE样品缓冲液裂解线粒体;也可先用Mito Solution重悬线粒体,再加入2x SDS-PAGE样品缓冲液。

      5. Cytochrome oxidase, Monoamine oxidase, Succinate dehydrogenas, Glutamate dehydrogenase可用作线粒体的标志酶。

       

      发表英文论文时可供参考的书写方式:Mitochondria Isolation Kit was purchased from Applygen Technologies Inc. (Beijing, China)

       

      发表中文论文时可标明:线粒体/胞浆制备试剂盒购自北京普利莱基因技术公司

       

      目前,使用我公司线粒体/胞浆蛋白制备试剂盒发表的SCI英文论文已有多篇,以下供参考:

       

      1、Shangguan W J, Li H, Zhang Y H. Induction of G2/M phase cell cycle arrest and apoptosis by ginsenoside Rf in human osteosarcoma MG‑63 cells through the mitochondrial pathway[J]. Oncology reports, 2014, 31(1): 305-313.

      2、Zhou X, Zhao Y, Fang Y, et al. Hes1 is upregulated by ischemic postconditioning and contributes to cardioprotection[J]. Cell biochemistry and function, 2014, 32(8): 730-736.

      3、Zhang P, Pan H, Wang J, et al. Telomerase activity-independent function of telomerase reverse transcriptase is involved in acrylamide-induced neuron damage[J]. Biotechnic & Histochemistry, 2014, 89(5): 327-335.

      4、Zhou X L, Wan L, Xu Q R, et al. Notch signaling activation contributes to cardioprotection provided by ischemic preconditioning and postconditioning[J]. J Transl Med, 2013, 11: 251.

      5、Zhang F, Zhang L, Sun L, et al. Effects of Fluid Shear Stress on Expression of Smac/DIABLO in Human Umbilical Vein Endothelial Cells[J]. Current Therapeutic Research, 2013, 74: 36-40.

      6、Zhao G, Ma H, Shen X, et al. Role of glycogen synthase kinase 3β in protective effect of propofol against hepatic ischemia–reperfusion injury[J]. Journal of Surgical Research, 2013, 185(1): 388-398.

      7、Sun L L, Zhang L, Meng X L, et al. Effects of fluid shear stress on the expression of Omi/HtrA2 in human umbilical vein endothelial cells[J]. Molecular medicine reports, 2013, 7(1): 110-114.

      8、Sun L Q, Zhao J, Zhang T T, et al. Protective effects of Salvianolic acid B on Schwann cells apoptosis induced by high glucose[J]. Neurochemical research, 2012, 37(5): 996-1010.

      9、Zhou Q, Li Y, Jin J, et al. Lx2-32c, a novel taxane derivative, exerts anti-resistance activity by initiating intrinsic apoptosis pathway in vitro and inhibits the growth of resistant tumor in vivo[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2012, 35(12): 2170-2179.

      10、Li W, Zhang J, An W. The conserved CXXC motif of hepatic stimulator substance is essential for its role in mitochondrial protection in H 2 O 2-induced cell apoptosis[J]. FEBS letters, 2010, 584(18): 3929-3935.

      11、Fang N X, Yao Y T, Shi C X, et al. Attenuation of ischemia–reperfusion injury by sevoflurane postconditioning involves protein kinase B and glycogen synthase kinase 3 beta activation in isolated rat hearts[J]. Molecular biology reports, 2010, 37(8): 3763-3769.

      12、Zhao C Q, Zhang Y H, Jiang S D, et al. Both endoplasmic reticulum and mitochondria are involved in disc cell apoptosis and intervertebral disc degeneration in rats[J]. Age, 2010, 32(2): 161-177

      13、Yin Q, Jin P, Liu X, et al. SDF-1α inhibits hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis in mesenchymal stem cells through PI3K/Akt and ERK1/2 signaling pathways[J]. Molecular biology reports, 2011, 38(1): 9-16.

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