产品名称:TA快速连接试剂盒(pUC-T Simple)(含载体,连接酶)
英文名称:pUC-T Simple TA Cloning Kit
产品规格:20次
pUC-T Simple载体是一种高效克隆PCR产物的专用载体,它是由pUC18载体在EcoR V酶切位点处切开,在两侧的3'端添加T而成。由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR产物的3'端添加一个A,可以与pUC-T 3'端的T互补连接,同时它消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点,克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下,需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。此时如果使用PCR扩增引物导入的酶切位点进行DNA酶切时,酶切反应将不会受到T载体上其它多克隆酶切位点上的限制酶影响,可以大大提高酶切效率,增加亚克隆成功率。
试剂盒中配备高效率的T4 DNA Ligase和为快速高效DNA连接优化的2×Quick Ligation Reaction Buffer。连接效率相当于用T4 DNA Ligase 进行常规连接1小时。带有插入片段的重组子可根据α互补原理,进行蓝白斑筛选,判断载体中有无外源基因的插入。克隆后可以用BcaBEST Sequencing Primers和 M13通用引物对PCR产物进行测序。
试剂盒组成:
组份
20次
pUC-T Simple(50 n g/μl)
20μl
Control Insert(50ng/μl)
10μl
Quick T4 DNA Ligase
20μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer
120μl
注意事项:
1、Insert DNA 要求
1)连接使用的PCR片段3’末端应带有“A”尾。有些高保真DNA聚合酶,如我公司的Pfu扩增的PCR产物是平滑末端,可使用加A试剂盒加上A尾后,再进行T载体克隆。
2)PCR产物建议进行切胶回收纯化后再进行T载体克隆,以免PCR产物中的非特异片段或残存引物等杂质影响。推荐使用WE0168快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。
2、连接反应要求
1)本试剂盒能使大多数连接反应在25℃条件下5分钟甚至更短时间内达到反应终点,增加反应时间反应效率不会增强。如用快速连接反应1小时后,转化效率会明显降低;如25℃快速连接反应过夜,则转化效率会下降到75%。
2)2×Quick Ligation Reaction Buffer含有ATP,使用前置于冰上使其融化后充分混匀,建议初次使用分装成小管冻存,避免其反复冻融影响DNA连接效率。
3)由于T4 DNA Ligase中含有甘油,比较粘稠容易挂壁,建议使用之前短暂离心将液体收集到管底,取样时枪头尽量不要深入液面太深,以免粘在枪头上造成损失。
4)如快速连接产物用于电转,因快速连接反应体系中的PEG会影响电转效率,建议使用离心柱将连接产物进行DNA纯化(如WE0170快速DNA产物纯化试剂盒)后再进行电转。