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北京百奥莱博科技有限公司
-20℃
100μl
特别提示:包括Oligo(dT)18 Primer在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
50μl反应体系 | 20μl反应体系 | 终浓度 | |
2×qPCR MasterMix | 25μl | 10μl | 1× |
上游引物 10μM | 1μl | 0.4μl | 0.2μM |
下游引物 10μM | 1μl | 0.4μl | 0.2μM |
ROX Slolution I or II(50×) | 1μl or 不加 | 0.4μl or 不加 | x |
模板 | ×μl | xμl | 10pg-100ng |
水 | 补至50μl | 补至20μl |
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
初始变性 | 95℃ | 10min* | 1 |
变性 | 95℃ | 15sec | 40 |
退火 | 55℃ | 30sec | |
延伸 | 72℃ | 30sec |
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
初始变性 | 95℃ | 10min* | 1 |
变性 | 95℃ | 15 sec | 40 |
退火和延伸 | 60℃ | 60 sec |
问题 | 可能原因 | 推荐的解决方法 |
无扩增曲线且无扩增产物(凝胶电泳) | 反应体系中有PCR反应抑制剂 | 更换或纯化模板DNA。 |
引物设计不合理 | 重新设计、合成引物。 | |
逆转录产物体积过量 | 减少逆转录产物量以不超过反应体系的10%。 | |
加样错误或有试剂未加 | 检查是否加了所有的所需试剂。 | |
引物的降解 | 通过PAGE电泳检测引物完整性。 | |
退火温度不正确 | 优化退火温度。 | |
无扩增曲线但有扩增产物(凝胶电泳) | qPCR仪设置不正确 | 检查dye selction,reference dye是否选择正确 |
失效的荧光检测 | 荧光检测应在PCR循环的退火/延伸阶段。 | |
荧光PCR仪问题 | 参考qPCR仪器说明书 | |
阴性对照(NTC)有扩增曲线 | ||
反应体系中有污染 | qPCR片段较小,极易造成环境中气溶胶污染。如果融解曲线分析,解链温度和目的片段相同,凝胶电泳中NTC中的片段大小和目的片段相同,极有可能是反应体系中某一或某些试剂污染所引起的。建议换至没有污染源的环境进行PCR体系的配制。 | |
引物二聚体 | 进行溶解曲线分析,如果扩增曲线的解链温度小于80℃,凝胶电泳片段大小和目的片度不符。请重新设计引物。 | |
提高退火温度3℃。 | ||
PCR效率高于110%(斜率>-3.1) | 有非特异性扩增 | 溶解曲线分析非特异性扩增;优化引物设计 |
PCR扩增效率低于90%(斜率<-3.6) | 反应体系中有PCR反应抑制剂 | 更换或纯化模板DNA |
PCR扩增条件不合适引起扩增效率降低。 | 确认引物浓度。注意qPCR Master Mix是否失效。 | |
引物设计 | 重新设计引物,避免扩增区域的DNA二级结构。 | |
实时荧光曲线线性不好 | 模板DNA含量较低或过高 | 应调整样品的DNA浓度。 |
模板DNA中含有抑制PCR扩增反应的物质 | 对模板DNA进行纯化或更换模板。 | |
质量不好的逆转录试剂盒合成的cDNA,逆转录反应液中所含的物质可能抑制PCR反应。 | 请降低样品浓度,或将样品纯化后再进行反应。建议使用品牌质量较好的cDNA合成逆转录试剂盒。 | |
CT值高于预期值 | 加入的模板量太少 | 适当增加模板量。 |
样品被降解 | 检查样品的完整性。 | |
引物不合适 | 重新设计合成引物。 | |
CT值低于预期值 | 加入了过多的模板 | 减少模板量。 |
PCR产物太长 | 一般采用100-150bp的产物长度,一般不超过500bp | |
CT值的标准差>0.16 | 取样不准确 | 每种样品的反应混合液单独配制,充分混匀; |
qPCR之前要离心,管壁不要沾有反应液。 | ||
ΔRn值太小 | PCR效率太低 | 优化PCR反应条件。 |
目标模板数太低 | 增加模板量。 | |
扩增曲线的荧光信号弱,或扩增曲线呈锯齿状 | ROX添加量太大 | 使请根据ROX使用方法和使用的PCR仪进行确定ROX的添加量。 |
荧光校正错误 | 请联系PCR仪器工程师或参照PCR仪器的使用说明书,进行本底和荧光校正。 | |
PCR的延伸时间过短即荧光读取时间不充分,荧光收集不能充分完成。 | 适当增加延伸时间。 | |
以少于PCR仪器标准条件的反应体积进行扩增,荧光收集量的误差会增大 | 应增加反应体积以满足PCR仪器标准。 |
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