名称:T4 DNA连接酶
货号:WE0239
规格:100U|500U
T4 DNA Ligase 是从表达T4 DNA Ligase 基因的大肠杆菌经诱导表达后分离纯化而来的,催化相邻DNA链的5’磷酸基团和3’羟基基团以磷酸二酯键结合反应。该酶可催化平末端或粘性末端DNA之间的连接,还可修复双链DNA、RNA、DNA/RNA杂交双链中的单链切口。本品可应用于DNA插入片段和载体DNA的粘性末端和平末端的连接,以及线性DNA的自身环化。
产品组成:
组份
100U
500U
T4 DNA Ligase,5 U/μl
20μl
100μl
10×Ligation Buffer
150μl
750μl
50%PEG Solution
150μl
750μl
实验前准备及重要注意事项 1、T4 DNA Ligase的zuì终用量不要超过推荐的用量,否则影响连接效率。
2、PEG可以极大提高平末端的连接效率,我们推荐加入终浓度为5% PEG Solution以提高平末端的连接效率。
3、为了提高转化效率,建议所加入连接产物的量不要超过感受态细胞体积的10%。
4、由于T4 DNA Ligase中含有甘油,比较粘稠容易挂壁,建议使用之前短暂离心将液体收集到管底,取样时枪头尽量不要深入液面太深以免粘在枪头上造成损失。
使用方法:
一、粘性末端的连接:
1、按以下体系配制反应液:
组份
20μl体系
终浓度
线性载体DNA
Xμl
20-100ng
插入DNA片段
Yμl
插入片段:载体1:1-5:1
10×Ligation Buffer
2μl
T4 DNA Ligase,5 U/μl
0.2μl
1 U
ddH2O
补充至20μl
2、涡旋震荡,瞬间离心,将管壁上的溶液收集到管底。
3、反应条件:22℃孵育10分钟。
4、瞬间离心,将管壁上的溶液收集到管底,65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase。
5、可取5μl连接产物热击转化50μl感受态细胞或取1-2μl连接产物电击转化50μl感受态细胞。
注意:如需电击转化,推荐用乙醇沉淀法去除T4 DNA Ligase后进行电击转化。
二、平末端的连接:
1.反应体系:
组分
20μl体系
终浓度
线性载体DNA
Xμl
20-100ng
插入DNA片段
Yμl
插入片段:载体1:1-5:1
10×Ligation Buffer
2μl
T4 DNA Ligase,5 U/μl
1μl
5 U
50%PEG Solution
2μl
5%
ddH2O
补充至20μl
20μl
2、涡旋震荡,瞬间离心,将管壁上的溶液收集到管底。
3、反应条件:22℃孵育1小时。
4、瞬间离心,将管壁上的溶液收集到管底,65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase。
5、可取5μl连接产物热击转化50μl感受态细胞或取1-2μl连接产物电击转化50μl感受态细胞。
注意:如需电击转化,推荐用乙醇沉淀法去除T4 DNA Ligase后进行电击转化。
三、线性DNA的自身环化:
1、反应体系:
组分
50μl体系
终浓度
线性载体DNA
Xμl
5-50ng
10×Ligation Buffer
5μl
T4 DNA Ligase,5 U/μl
1μl
5 U
ddH2O
补充至50μl
50μl
2、涡旋震荡,瞬间离心,将管壁上的溶液收集到管底。
3、反应条件:粘性末端22℃孵育10分钟;平末端22℃孵育1小时。
4、瞬间离心,将管壁上的溶液收集到管底,65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase。
5、可取5μl连接产物热击转化50μl感受态细胞或取1-2μl连接产物电击转化50μl感受态细胞。
注意:如需电击转化,推荐用乙醇沉淀法去除T4 DNA Ligase后进行电击转化。