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慢病毒包装
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技术简介慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷1型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点,因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、microRNA研究以及活体动物实验中。
实验步骤
(1)慢病毒包装细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞,细胞密度为0.5×10时;重新接种于25mL的15cm细胞培养皿,37℃,50mL/LCO2培养箱内培养;
(2)制备慢病毒包装系统中四种质粒DNA溶液;
(3)当细胞密度达60%~70%时转染。将DNA和磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中,混匀,培养12h后弃去含有转染混和物的培养液,加入PBS15mL,轻摇后弃去,重复该步骤3次;
(4)每瓶细胞中加入含100mL/L小牛血清的细胞培养液15mL,继续培养48h;
(5)收集转染72h的293T细胞上清液;
(6)将收集的上清液于4℃,4000 g离心10 min,收集上清液;
(7)将各种不同RNA干扰质粒上清液以0.45 μm滤器过滤;
(8)于40mL超速离心管中,4℃,25000 r/min离心20min;
(9)而后以冰PBS液,分别溶于500 ul DMEM,和500 ul PBS重旋病毒沉淀于4℃溶解过夜。
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