Q:什么是MOl值?如何进行MOl值摸索? A:MOl(Muitiplicity Of Infection,感染复数)是指病毒感染细胞的比例。选择合适的MOl值,病毒的感染效率以及目的蛋白的表达量越高,相对细胞的毒性越小。对于分裂活跃的细胞,比如293细胞,MOl=1时,95%以上的细胞均可以表达目的基因。而对于非分裂细胞,比如原代细胞,感染效率较低,MOl值可能达到200-300.我们建议通过比较不同MOl(比如0、1、5、10、50、100等)感染细胞的结果(注意摸索是否需要填加polybrene),现在适合的MOl进行实验:可以先将培养好的细胞接种至96孔板,然后用携带报告基因EGFP的阴性对照慢病毒,按照不同MOl值比例感染细胞,进行MOl值摸索。
Q:慢病毒使用的安全性如何? A:慢病毒已经被全世界许多实验室应用,至今没有生物安全性出现问题的报道,但仍具有潜在的产生复制型慢病毒和致癌的风险,操作者在实验中仍需要保持高度警惕!所有操作均应尽量在生物安全2级实验室的安全柜中进行,并佩戴一次性口罩和手套,尤其要避免病毒接触口、眼、鼻、耳、伤口等身体开放性区域,避免产生气溶胶。显微镜台、生物安全柜台面等使用后,用75%乙醇擦拭。意外洒落的含病毒的液体,用卫生纸吸干后,用0.6%次氯酸.钠溶液浸泡被污染处1h。对共用实验室的人员进行慢病毒安全培训或提示。 . Q:在慢性毒介导的稳转株构建实验中,慢病毒感染细胞后,整合入基因组中的位点有多少? A :慢病毒的整合和加入的病毒量有关,加入量很多如MOI值达到100时可以进行多位点整合,最多5-10个,注意表达量的高低和整合位点与其在染色体上的位置有关。质粒很可能是整合在转录活性不强的区域,而慢病毒的偏好性在于转录活性非常强的区域。
Q:订购到的慢病毒如何保存和使用? A :包装好的慢病毒液全程采用干冰运输,快递至客户处。请务必注意查收,收到后请打开包装检查干冰是否还有剩余,病毒种类和规格是否发货单完全一致。请将慢病毒液在-80摄氏度保持,避免反复冻融,6个月内滴度不会明显下降,建议尽快使用完毕。对于保持6-12个月以上的样品,实验前需重新测定滴度。使用前从-80摄氏度冰箱取出病毒,置冰上融解,待用。一次用不完的病毒液可以放在4摄氏度冰箱 中,一周内使用完毕。
参考文献 1 Buchschacher GL Jr, Wong-Staal F.Development of Lentiviral Vectors for Gene Therapy for Human Diseasea. Blood2000,95(8):2499-2504. 2 Pandya S, Klimatcheva E, Planelles V. Lentivirus and foamy virus vectors: novel gene therapy tools Expert Opinionon Biological Therapy 2001,1(1):17-40. 3 Park F, Kay MA.Modifred HIV-1 based lentiviral vectors have an effect on viral transduction efficiency and geneexpression in vitro and in vivo. Mol Ther 2001,4(3):164-173.