1. 随机引物法进行DNA标记:
a. 参考如下表格设置反应体系:
DNA———————————————————————————————10µl(100ng)
Reaction Buffer (10X)——————————————————————5µl
125µM random decamer or hexamer primer——————————————10µl
补充无核酸酶的去离子水——————————————————————至40μl
混匀后沸水浴孵育5-10分钟,立即置于冰浴冷却。进行后续步骤前离心沉淀液
3 dNTP Mixture (0.25mM each , without the labeled—————————4μl
[α-32P]-dNTP, ~110 TBq/mmol (3000Ci/mmol)————————————1.85MBq (50μCi)
Klenow Fragment,Exo-———————————————————————1µl (5U)
补充无核酸酶的去离子水———————————————————————至50µl
b. 按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在zuì低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c. 对于random decamer primer,37℃孵育5分钟;对于random hexamer primer,37℃孵育10分钟。
d. 加入4μl 0.25mM dNTP,混匀后37℃孵育5分钟。
e. 加入1μl 0.5M EDTA,pH8.0终止反应。
f. 取1μl上述液体用于检测标记的效率。
g. 用Sephadex G-50或Bio-Gel P-60或其它适当试剂盒纯化标记好的探针。
2. 双链DNA 5’突出(5’ overhang)末端的标记:
a. 参考如下表格设置反应体系:
Digested DNA ——————————————————————————10~15µl(0.1~4μg)
Reaction Buffer (10X)——————————————————————2µl
[α-32P]-dNTP, ~15-30 TBq/mmol(400-800Ci/mmol) —————————0.74 MBq(20μCi)
或 [α-32P]-dNTP, ~110 TBq/mmol(3000Ci/mmol)———————————2.96 MBq(80μCi)
3 dNTP Mixture (2.5mM each , without the labeled)————————2μl
Klenow Fragment,Exo-———————————————————————0.2μl (1U)
补充无核酸酶的去离子水———————————————————————至20µl
b. 按上述体系配好之后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在zuì低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c. 30℃孵育15分钟。
d. 75℃孵育10分钟终止反应。