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    Western Blot检测

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    Western Blot检测

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    • 服务名称: Western Blot检测
      Western Blot 检测实验流程
      1、实验材料
      1.1 样本取材
      1.2 主要实验仪器
      稳压稳流电泳仪        美国 Bio-Rad  
      垂直电泳槽    美国 Bio-Rad
      半干转电转印仪  美国 Bio-Rad         
      数码凝胶成像系统     BINTA公司
      计算机图像分析仪     Image-Pro Plus Analysis Soft ware
      4低温高速离心机   Thermo    美国 
      常温高速离心机          eppendorf     德国       
      电子天平                      Sartouris            德国
      紫外分光光度计          Biophotometer  德国
      微量加样器      eppendorf     德国
      恒温水浴箱      上海
      液氮及便携式标本贮藏罐         四川
      1.3 主要实验试剂
      琼脂糖,丽春红,十二烷基硫酸钠,β-巯基乙醇,蛋白质分子量Marker,PVDF膜、感光胶片等。二抗为辣根酶标记山羊抗兔IgG,山羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥公司)。
      2、实验方法
      2.3 Western-blot 所需试剂
      (1)样品缓冲液:70mmol/L Tris-HCl (pH6.8),8mol/L Urea, 2.4% SDS,10% 甘油,10mmol/L EDTA·2H2O ,0.01% 溴酚蓝。
      (2)分离胶缓冲液:称取4.54 g的Tris 用ddH2O溶解,用HCl调PH至8.8,然后加ddH2O至100ml的终体积。即成pH 8.8 0.375mol/L Tris-HCl 缓冲液。过滤后于4℃保存。
      1. 电泳缓冲液:称取3.03g Tris,18.77g甘氨酸,1g SDS,用蒸馏水溶解至1000ml,即成0.025mol/L Tris,0.25mol/L 甘氨酸电泳缓冲储液。
      2. 转移缓冲液:称取3.03g Tris,14.4g甘氨酸,0.5g SDS,用蒸馏水溶解至800ml,再加入200ml甲醇混匀,即成0.025mol/L Tris,0.25mol/L 甘氨酸电泳缓冲储液。
      (5)0.45μm 硝酸纤维素膜: 美国Millipore 公司
      (6)高熔点琼脂糖。
      (7)封闭缓冲液:含5%脱脂奶粉、0.01%防沫剂,0.025% NaN3溶于TBS-T 缓冲液。
      (8)PBS缓冲液:8g NaCL ,3.23g Na2HPO4·12H2O,0.2gKH2PO4,0.2g KCl,用蒸馏水溶解至1000ml。
      (9)PBS-T 漂洗液:含0.1%Tween-20的TBS。
      (10)蛋白质Marker: 美国MBI公司
      (11)显影液、定影液:保定乐凯照相化学有限公司。

      2.4 Western-blot 测定方法
      2.4.1 样品制备
      取3µl血清样本与10µl样品缓冲液混匀,56℃水浴30min。
      2.4.2 制胶及上样
      调烘箱温度至45℃,将夹好的边条厚度为1mm的垂直制胶架放在烘箱中预热。
      配制2%琼脂糖凝胶:取 0.375mol/L Tris-HCl(PH8.8)9ml,10%SDS 1ml,琼脂糖0.2g,于锥形瓶中混匀,用封口膜封住瓶口防止水分蒸发,将锥形瓶放到微波炉中加热,加热10S左右就要拿出来摇一摇,再继续加热,直至琼脂糖全部融化,不要过沸使液体喷溅出来。
      将琼脂糖灌满预热好的垂直制胶架上的玻璃板,插入梳子。静置至琼脂糖凝胶凝固。
      将梳子拔出,将凝胶玻璃板垂直固定于凝胶电泳仪上,加入电泳缓冲液。将制备好的样品按顺序加入点样孔中。每孔13µl(3µl血清样本+10µl样品缓冲液)
      2.4.3 电泳
      接通凝胶电泳仪的电源,设置电流4mA,跑16h。
      2.4.4 蛋白质的电转移和膜封闭
      6 张与电泳凝胶大小一致的Whatman 3mm 滤纸和一张PVDF膜,,PVDF膜先用甲醇浸泡5min,然后将滤纸和PVDF膜用转移缓冲液浸泡15min。采用湿转移仪进行蛋白质的电转移。恒压30V,转14h。转移结束后,PVDF膜取出标记膜的方向。用5%PBS-T 脱脂奶粉封闭,室温振荡60min
      2.4.5 抗原抗体反应及显影
      封闭结束后,用PBS-T 漂洗液洗膜10min×3 次,将膜移入杂交袋中,加入用适当漂洗液稀释的抗体,封口,4℃孵育过夜;再用大量PBS-T漂洗液洗膜10min×3 次,然后将PVDF膜移入另一新的杂交袋,加入漂洗液稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗,37℃振荡60min,大量PBS-T 漂洗液洗膜10min×3次;将PVDF膜置ECL 混合液中于室温下振荡温育5 分钟,每平方厘米膜片至少使用0.125mlECL 混合液以覆盖全膜片,用平头镊钳住膜片,垂直置于吸水纸以吸去过量试剂,置膜片于两层保鲜膜之间,小心赶尽气泡。将膜片吸附蛋白面朝上,置于X 光片盒中,于暗室中压上X 光片,感光数分钟将已暴光的胶片放入显影液中显影,直至出现清晰影像,然后将胶片转入清水中漂洗片刻,立即将胶片放入定影液中定影。最后清水冲洗,晾干保存,扫描
      2.4.6 蛋白图像分析

      2.4.7 统计学分析
      数据用x±s表示,统计分析采用SPSS16.0软件进行ANAVO检验。

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