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    实时荧光定量PCR服务

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    实时荧光定量PCR服务

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      • 提供商:

        Microread

      • 服务名称:

        实时荧光定量PCR

      简介:实时荧光定量PCR,绝对定量,相对定量,SYBR法,TaqMan探针法

      荧光定量PCR技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时监控反应过程。随着 PCR 反应的进行,反应产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一次荧光强度信号,这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,结合相应的软件进行分析,可以得到荧光扩增曲线,计算待测样品初始模板的量。实时荧光定量PCR技术是一次由定性技术向定量技术的飞跃,运用该项技术,可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析。
       

      服务项目

      相对定量:
      对各类型样本中各种RNA差异表达相对定量,以及DNA拷贝数变异相对定量。包括DNA/RNA提取、反转录和扩增,采用SYBR Green I法或TaqMan探针法两种方式,一般采用2-ΔΔ Ct法进行计算。每个样本重复三次,我公司提供常用内参基因引物。

      1.mRNA 表达检测服务及引物/探针设计
      2.lncRNA表达检测服务及引物/探针设计
      3.miRNA表达检测服务及引物/探针设计
      4.circRNA表达检测服务及引物/探针设计
      5. 基因拷贝数变异检测

      绝对定量:
      需要制备标准品并建立标准曲线,然后检测目的样本中的基因,比对标准曲线得到基因准确拷贝数。常见用于质粒拷贝数计算、DNA拷贝数分析等。


      基因分型:

      针对染色体上不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针,进行实时荧光PCR扩增。通常用于少量SNP位点分析(详见DNA册子)


      技术优势

      10+年的实时荧光定量经验,确保可靠的高质量结果;

      采用先进的Thermo Fisher Q6实时荧光定量PCR仪进行荧光定量反应,高效的提供可靠的数据;

      丰富的引物设计经验,可根据客户需求和RNA种类的不同,设计特异性高,反转录效果好的引物;

      采用与客户需求匹配的合适内参,确保高数据质量;

      检测内容全面覆盖各类RNA,包括mRNA、microRNA、lncRNA、circRNA等;

      丰富的各类检材RNA提取经验,可针对血液,组织,动植物样本,微生物样本和各类复杂特殊样本进行RNA提取;

      个性化定制的服务,丰富的项目经验,先进的技术平台,全面的项目报告,加速您的科研。
       

      TaqMan探针法和SYBR Green法示意图


      案例解析

      线粒体DNA.A3273G突变疾病中lncRNA充当竞争性内源RNA机制和潜在的生物标记鉴定
       

      本研究利用高通量全转录组分析,结合实时荧光定量PCR和生物信息学的方法对于与线粒体相关疾病病人中的非编码RNA充当竞争性内源RNA机制和相关非编码RNA进行了鉴定。基于二代测序数据基础上的表达量分析,对筛选出来的有意义的miRNA,lncRNA和mRNA进行实时荧光定量,结果如下图所示。

       

      Wang, Wei, et al. "Identification of miRNA, lncRNA and mRNA-associated ceRNA networks and potential biomarker for MELAS with mitochondrial DNA A3243G mutation."Scientific Reports(2017).(Impact factor: 4.259)

      miRNA,lncRNA和mRNA荧光定量结果示意图

       


       

      环状RNA荧光定量验证二代测序后基因表达量分析


      利用环状RNA测序构建环状RNA表达谱,揭示了circLMO7可以通过充当miR-378a-3p分子海绵来调控牛成肌细胞的分化与存活。测序后鉴定出12,981个circRNAs,挑选其中17个差异最显著的circRNA进行qRT-PCR验证。

       

      Wei, Xuefeng, et al. "Circular RNA profiling reveals an abundant circLMO7 that regulates myoblasts differentiation and survival by sponging miR-378a-3p."Cell death & disease. (2017): e3153.(impact Factor:5.9)

      A.17个显著差异表达circRNAs二代测序后的表达量分析

      B.17个环形RNA的荧光定量结果示意图(红色:成年牛细胞 蓝色:胚胎牛细胞)


      常见问题

      qRT-PCR可以用来做什么?

      就RNA层面来说,RNA的qRT-PCR主要用来检测不同种类RNA的表达量和表达差异。同时,由于qRT-PCR具备精确、可靠检测各类RNA表达量的特点,因此常规被用来验证二代测序表达量计算结果。除相对定量以外,尚可以通过实现构建标准曲线的方法实现绝对定量,更加精确的揭示各类RNA的表达量。就DNA层面来说,实时荧光定量可以用来进行基因分型,拷贝数变异检测等试验。

       

      荧光扩增曲线和溶解曲线的意义分别是什么?

      荧光扩增曲线在在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,而每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为Ct值。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

      溶解曲线是为了区分样品是否有非特异性扩增和初始模板有无被污染的情况,如果出现单一峰且峰值在Tm值位置出现,这就证明没有非特异性扩增,且初始模板没有被污染;如果出现多个峰,估计是有非特异性扩增或初始模板被污染了的情况。TaqMan探针法由于特异性高的特点,因此利用TaqMan探针法进行荧光定量实验后结果中是不包含溶解曲线的,但是探针法完全可以进行绝对定量和相对定量。


      蓝色横线表示阈值,而扩增曲线(红色)与阈值交会的点即为该样本的Ct值(又称Cp或Cq值)

       

      绝对定量的标准品如何准备?

      在进行绝对定量的时候,标准品的制备是十分必要的,具体制备标准品的步骤如下:首先根据提供的基因设计特异引物---PCR扩增---PCR产物回收---TA克隆---挑选成功克隆菌落---菌落鉴定(利用M13引物进行鉴定)---提取质粒,此时提取的质粒就可以作为标准品。随后,会对提取的质粒进行梯度稀释,荧光定量,数据分析等。

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