本试剂盒灵敏度极高,比DAB显色的灵敏度至少高1000倍,比原Pierce公司(现Thermo公司)的SuperSignal West Pico Substrate的灵敏度高10倍以上,实际检测效果与原Pierce公司的SuperSignal West Dura和SuperSignal West Femto的检测灵敏度相近。对于辣根过氧化物酶的最低检测灵敏度可以达到飞克级,500飞克辣根过氧化物酶用本试剂盒检测并用化学发光仪进行发光强度的定量检测时,信噪比大于5。
1. DNA 3’末端标记: a. 参考如下表格设置反应体系: 待标记DNA————————————————————10 pmol of 3"-termini Reaction Buffer (5X) ——————————————10µl [α-32P]-ddATP, ~10TBq/mmol (3000Ci/mmol)————1.85 MBq (50µCi) TdT (20U/µl) ——————————————————2µl 补充无核酸酶的去离子水 —————————————至50µl b. 按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。 c. 37℃孵育15分钟。 d. 70℃孵育15分钟或加入5µl 0.5M EDTA终止反应。 说明:标记的效率和3’羟基末端的类型有关,3’突出末端的标记效率要显著高于3’缩进末端或平末端的标记效率。
2. DNA末端加尾(DNA Tailing): a. 参考下表格设置反应体系: DNA片段 ————————————————————1 pmol of 3"-termini Reaction Buffer (5X)——————————————4µl dATP or dTTP——————————————————130pmol 或 dGTP or dCTP (四种中通常只需加入一种)————60pmol TdT (20U/µl)——————————————————1.5µl 补充无核酸酶的去离子水—————————————至20µl b. 按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。 c. 37℃孵育15分钟。 d. 70℃孵育15分钟或加入5µl 0.5M EDTA终止反应。 说明:在上述反应条件下,每个3’羟基末端可以加上100-130个dA或dT,或20-30个dC或dG。