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    BSP单位点甲基化检测(高通量测序版)

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    BSP单位点甲基化检测(高通量测序版)

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    • 提供商: Illuminna
      服务名称: 高通量版BSP甲基化检测


      BSP简述

        BSP(Bisulfite Sequencing PCR): Frommer等提出的研究DNA甲基化方法,此方法可靠性及精确度高,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。结合高通量测序,可以发现更精确的甲基化修饰信息。
       

      BSP实验流程

      1.    基因组DNA提取和定量
      2.    NaHSO3 处理(包括纯化和脱碘基反应)使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。
      3.    处理后的DNA纯化回收
      4.    根据目的基因启动子序列设计相应引物,使用优化过的BSP引物进行PCR扩增
      5.    PCR产物高通量测序
      6.    数据分析,发掘每个CpG位点的甲基化信息

       

      BSP的技术优势
       
       
       

      HT-BSP案例展示
      目的:检测基因BDNF的甲基化水平!

      第一步:样本DNA提取及质控
              共有6个血液样品,样本名称参照管上的原始编号(3: 3混样)。
              B190-1(病例)、B190-2(对照)以下分别简称“样品1”、“样品2”, 测试基因共10个片段(具体检测片段数量以最终引物设计后为准!)



      第二步:查询基因BDNF的CpG岛

                在UCSC中查询,结果发现4个CpG岛,多位于BDNF基因上游及内部,有检测意义。


              1、CpG: 80,基因组位置chr11:27700115-27701092,978bp。  分3段检测
              2、CpG:54,  基因组位置chr11:27719098-27719618 ,521bp。分2段检测
              3、CpG:14, 基因组位置chr11:27720513-27720726 , 214bp。   分1段检测
              4、CpG:81, 基因组位置chr11:27721926-27723017,1092bp。 分4段检测
       


      第三步:引物设计(以CpG:54为例)

      >hg38_cpgIslandExt_CpG: 54 range=chr11:27718898-27719818 5‘pad=200 3’pad=200 strand=+ repeatMasking=none(加粗斜体下划线部分为引物位置)


      第四步:NaHSO3 处理及PCR扩增

                   1.严格按照试剂盒说明书操作,取基因组DNA 1ug进行NaHSO3 转化并纯化回收。
                   2.PCR扩增
                   3.切胶回收
       

      第五步:Illumina 建库和测序

          1. PCR产物检测合格后,再经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化等步骤完 成整个文库制备工作。文库构建完成后,先使用Qubit2.0进行初步定量,稀释文库至1.5ng/ul,随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测,insert size符合预期后,使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度 >2nM),以保证文库质量。文库构建原理图如下:
                     

       
          2. 上机测序
              库检合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina HiSeq测序。
       


      第六步:下机数据分析

       1. 下机原始数据,经过去除低质量数据之后,采用perl 脚本结合PCR引物5’段barcode 序列将文库信息分离到对应样品。分离样品统计如下:
            
       
      2. 甲基化水平分析
          通过计算甲基化状态序列/(甲基化状态序列+非甲基化状态序列)得到甲基化比例,并计算出两组的差异甲基化水平(Diff_meth=实验组甲基化比例-对照组甲基化比例),当差值>0.1(即百分之十)时,认为该CG位点存在甲基化差异。为了全面直观的展示样品之间的目的基因甲基化水平,做无监督聚类分析,以热图形式显示。
       
      3. 目的基因待测片段中 CG位点的甲基化点状图
         点状图是展示甲基化的经典方法,白色空心点表示未发生甲基化的CG位点,黑色实心点表示发生甲基化的CG位点。

      4. 目的基因待测片段的综合甲基化水平柱状图
          分别综合统计整个序列在实验组和对照组中的甲基化比例(黑色实心点数/黑色实心点数+白色空心点数),将实验组与对照组的甲基化比例为数据源,制作柱状图。
       

      BSP甲基化检测的样品要求


      浓度>100ng/ul(浓度最低不能低于40ng/ul);体积20-30ul,每个样品总量不少于2μg;-80度保存,干冰运输。
      备注:样品是否满足建库测序要求以PCR结果为准,未达到此标准的样品可以尝试进行NaHSO3 处理→PCR实验,PCR不成功收取实验成本费。

       

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