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    研选Rac activation assay kit

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    Rac activation assay kit

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      • 货号:

        80501

      • CAS号:

        80501

      • 供应商:

        NewEastBio

      • 数量:

        30000

      • 英文名:

        Rac activation assay kit

      • 保质期:

        两年

      • 保存条件:

        -20℃

      • 规格:

        20T

      Rac活性检测试剂盒
      商品编号:80501

      产品说明
      小G蛋白是从属于细胞调节因子中的一个超家族。Rho家族是小G蛋白中的一个亚家族,它在细胞运动、细胞分裂以及基因转录中发挥主要作用。而本试剂盒Rac Activation Assay Kit中的Rac就属于Rho亚家族中的一种, Rac参与生理活动过程中其分子结构会呈现出2种相互转换的形式:与GTP结合的激活状态和与GDP结合的非活性状态。
      目前Rac蛋白活性的检测主要是依据小GTP酶Rac可以与p21活化激酶(PAK)的p21结合区域(PBD)结合,使PAK活化从而发挥生物学功能,进而间接的进行Rac活性功能的监测。然而此方法在检测过程中存在着一定的局限性比如GTP水解成GDP的速度过快以及Rac-GTP结合蛋白与PBD结合区域之间较低的亲和力,导致这种检测方法的重复性较差。
      而武汉纽斯特生物技术有限公司推出的Rac Activation Assay Kit活性检测试剂盒主要是依据单克隆抗体能够特异性的识别特殊构象的Rac-GTP结合蛋白,而不识别Rac-GDP结合蛋白,进而简单并且快速的进行Rac的活性检测。同时试剂盒中的Rac-GTP单克隆抗体也可以进行免疫组化实验中细胞和组织中Rac的活性监测。
      每套试剂盒可以进行20次检测。

      检测原理
      武汉纽斯特生物技术有限公司的Rac活性检测试剂盒主要是利用识别蛋白特异构象的Rac-GTP单克隆抗体特异性的去检测细胞提取物或者体外的(样品需要进行GTPγS活化处理)活性Rac-GTP的水平。简言之,特异性识别Rac活化构象的鼠单克隆抗体可以特异性结合细胞裂解液中的Rac-GTP活性蛋白,然后利用protein A/G将抗原抗体的结合物吸附下来,再利用特异性识别Rac活化构象的兔多克隆抗体进行免疫印迹分析进行检测。

      试剂盒成分
      1. 特异性识别Rac活性构象的鼠单克隆抗体(Anti-active Rac, Mouse Monoclonal Antibody (Catalog No. 26903)):小管装--30ul (抗体浓度是1mg/ml),抗体溶于PBS(pH 7.4)并包含50%的甘油和0.05%的die dan hua na。此抗体可以特异性识别所有脊椎动物中的Rac-GTP。
      2. Protein A/G agarose (Catalog No. 30301) :小管装—400ul包含200ul Protein A/G agarose和200ul 20%乙醇溶液。(使用时溶液需要充分混匀,再吸取)
      3. 5X Assay/Lysis Buffer (Catalog No. 30303):小瓶装—30mL包含250 mM Tris-HCl (pH 8.0), 750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 5% Triton X-100。
      4. 特异性识别Rac活性构象的兔多克隆抗体(Anti-Rac, Rabbit Polyclonal Antibody (Catalog No.21003)):小管装--30ul (抗体浓度是1mg/ml),抗体溶于PBS(pH 7.4)并包含有50%的甘油。
      5. 100 X GTPγS (Catalog No. 30302) :小管装—100ul (10 mM) ,实验中0.5mL细胞裂解液使用5ul GTPγS标记。
      6. 100 X GDP (Catalog No. 30304) :小管装—100ul (100 mM) ,实验中0.5mL细胞裂解液使用5ul GDP标记。

      储存条件
      试剂盒的成分在试剂盒的有效期限内必须存放于4°C条件下保存。
      试剂(试剂盒内不提供,由实验者自行配置)
      1. 刺激和未刺激的细胞裂解物;
      2. 蛋白酶抑制剂;
      3. 4 °C 摇杆或者摇床;
      4. 0.5 M EDTA (pH 8.0);
      5. 1 M MgCl2;
      6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer;
      7. 电泳和免疫印迹相关试剂;
      8. 免疫印迹缓冲液TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05%
      Tween-20);
      9. 免疫印迹封闭缓冲液 (TBST containing 5% 脱脂奶粉 or 3% BSA);
      10. PVDF或硝酸纤维素膜;
      11. 二抗;
      12. ECL 检测试剂;

      试剂制备
      1X Assay/Lysis Buffer:实验前用去离子水将5X的Assay/Lysis缓冲液稀释成1X的缓冲液,并在使用前加入蛋白酶抑制剂如1 mM PMSF, 10 μg/mL leupeptin(亮肽素),或 10 μg/mL aprotinin(抑肽酶)。

      样品处理
      贴壁细胞
      1. 培养细胞密度达到大约80%-90%之间(直径10 cm培养皿,~107个细胞),并用活性剂或抑制剂进行处理。
      2. 吸去培养基并用冰冷的PBS洗涤两次。
      3. 向细胞中加入1X Assay/Lysis缓冲液(每个直径10cm的组织培养皿中加入0.5-1mL)。
      4. 将培养皿放置于冰上处理10-20分钟。
      5. 用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。
      6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。
      7. 如果核发生裂解,细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时,将细胞裂解物用27½的注射器针头来回吸取3-4次,以破坏基因组DNA,从而避免上述情况的出现。
      8. 4°C 12000 g, 离心10 min。
      9. 收集上清(~1-2 mg总蛋白)并放置于冰上使用。如果样品不立即使用,请将处理后的样品存放于-70°C条件下。
      悬浮细胞
      1. 培养细胞并用活化剂或抑制剂进行处理。
      2. 计数细胞后离心。
      3. 吸去培养基并用冰冷的PBS洗涤两次。
      4. 向细胞中加入1X Assay/Lysis缓冲液(每个直径10cm的组织培养皿中加入0.5-1mL)。
      5. 反复吹打细胞进行裂解。
      6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。
      7. 如果核发生裂解,细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时,将细胞裂解物用27½的注射器针头来回吸取3-4次,以破坏基因组DNA,从而避免上述
      情况的出现。
      8. 4°C 12000 g, 离心10 min。
      9. 收集上清(~1-2 mg总蛋白)并放置于冰上使用。如果样品不立即使用,请将处理后的样品存放于-70°C条件下。
      体外用GTPγS/GDP处理蛋白以用作阳性和阴性的对照
      注意:在细胞体内环境条件下大约有10%的Rac被激活,而在体外用GTPγS处理大约有90%的Rac被激活。
      1. 准备两个离心管,每个管中各加入0.5 mL的细胞提取物(如果是纯的Rac蛋白则每个管中加入的蛋白量为1ug)。
      2. 每个管中加入20ul 0.5M EDTA(终浓度即为20 mM)。
      3. 一个管中加入5ul的100X GTPγS(终浓度即为100 uM)作为阳性对照。另一个管中加入5ul的100X GDP(终浓度即为1 mM)作为阴性对照。
      4. 将离心管置于30°C条件下反应30 min并不断搅动。
      5. 终止反应:将管置于冰上并加入32.5ul 1M MgCl2(终浓度即为60mM)。
      检测步骤
      Ι。活性Rac Pull-Down实验
      1. 等分0.5-1 mL(总蛋白的含量大约为1mg)的细胞裂解物至微量离心管中。
      2. 向管中加入1mL的1X Assay/Lysis 缓冲液。
      3. 向管中加入1ul的活性Ras单克隆抗体。
      4. 用涡旋振荡仪将protein A/G凝胶柱充分混匀,然后快速的吸出20ul悬浮珠浆液加入离心管中。
      5. 将管置于4°C条件下孵育1H,并轻轻的进行摇动。
      6. 5000g,离心1分钟。
      7. 弃上清,这一步要非常小心以避免珠子的损失。
      8. 用0.5 mL的1X Assay/Lysis缓冲液洗涤珠子三次,离心并弃去上清。
      9. 最后一次洗涤后,小心的移去所有的上清。
      10. 用20ul 的2X SDS-PAGE样品缓冲液重悬样品。
      11. 样品煮沸5min。
      12. 5000g,离心10s。
      II. 电泳和转膜
      1. 取15ul样品/孔上样17%配体胶。
      2. 按照制造商的说明进行SDS-PAGE。
      3. 按照制造商的说明将凝胶蛋白转到PVDF或硝化纤维素膜。
      III.免疫印迹反应和检测(所有步骤都是在室温下进行,并不断搅拌)
      1. 将PVDF膜浸入100%甲醇15s,然后在室温放置5 min晾干。
      注意:如果使用的是硝化纤维素膜,此步省略。
      2. 封闭:用TBST缓冲液配制5%的脱脂牛奶或者3%BSA在室温下孵育1H进行封闭,并需要恒定振荡。
      3. 孵育一抗:用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA稀释特异性识别Rac活性构象的兔多克隆抗体(稀释比例为1:50-1:1000,主要根据样品中含有的Rac蛋白的量),室温下孵育1-2小时,或者4°C条件下过夜孵育。
      4. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。
      5. 孵育二抗:(例如羊抗兔IgG-HRP),用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA按1:1000稀释比例稀释后使用,室温下孵育1小时并恒定振荡。
      6. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。
      7. 使用实验者所选择的检测方法进行显色如ECL显色法
      示例结果
      下图展示的是武汉纽斯特生物技术有限公司的Rac活性试剂盒的典型结果。下面的数据仅供参考。
      Rac活性分析。小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)用血小板衍生因子(PDGF)处理(Lane 2)和未处理(Lane 1)。细胞裂解物用特异性识别Rac活性构象的鼠单克隆抗体(Cat. # 26903)孵育(上图)。活性Rac珠子颗粒用特异性识别Rac活性构象的兔多克隆抗体(Cat # 21003)进行免疫印迹实验。底部的图展示的是细胞裂解液的活性Rac的Western blot实验结果。(底图SDS-PAGE的上样量是上图SDS-PAGE上样量的5%。)

      参考文献
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      Cytoskeleton Volume 71, Issue 4, pages 257–272, April 2014
      2.  Immunofluorescence and Confocal Microscopy of Neutrophils
      Neutrophil Methods and Protocols Methods in Molecular Biology Volume 1124, 2014, pp 251-268
      3.  A link between the nuclear-localized srGAP3 and the SWI/SNF chromatin remodeler Brg1
      Molecular and Cellular Neuroscience Volume 60, May 2014, Pages 10–25
      4.  SHP2 Phosphatase Promotes Mast Cell Chemotaxis toward Stem Cell Factor via Enhancing Activation of the Lyn/Vav/Rac Signaling Axis
      The Journal of Immunology April 14, 2014 1301155
      5.  ROBO1, a tumor suppressor and critical molecular barrier for localized tumor cells to acquire invasive phenotype: Study in African-American and Caucasian prostate cancer models
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      6.  Transcription factors NRF2 and nf-kb are coordinated effectors of the RHO family, GTP binding protein rac1 during inflammation
      J Biol Chem. 2014 May 30;289(22):15244-58
      7.  Canonical and Non-canonical G-protein Signaling Helps Coordinate Actin Dynamics to Promote Macrophage Phagocytosis of Zymosan
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      8.  p53 Down Regulates PDGF-Induced Formation of Circular Dorsal Ruffles in Rat Aortic Smooth Muscle Cells
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      9.  LPA-mediated migration of ovarian cancer cells involves translocalization of Gαi2 to invadopodia and association with Src and β-pix
      Cancer Lett. 2015 Jan 28;356(2 Pt B):382-91
      10.  cAMP controls the restoration of endothelial barrier function after thrombin-induced hyperpermeability via Rac1 activation
      Physiological ReportsPublished 24 October 2014Vol. 2no. e12175DOI: 10.14814/phy2.12175
      11.  Cisplatin at Sub-toxic Levels Mediates Integrin Switch in Lung Cancer Cells
      Anticancer Research December 2014 vol. 34 no. 12 7111-7117
      12.  Semaphorin-3F suppresses the stemness of colorectal cancer cells by inactivating Rac1
      Cancer letters. March 1, 2015Volume 358, Issue 1, Pages 76–84.
      13.  Geometry sensing through POR1 regulates Rac1 activity controlling early osteoblast differentiation in response to nanofiber diameter
      Integr Biol (Camb). 2014 Dec 24
      14.  Inhibition of Rac1 Activity in the Hippocampus Impairs the Forgetting of Contextual Fear Memory
      Mol Neurobiol. 2015 Jan 24
      温馨提示:不可用于临床治疗。

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    武汉纽斯特生物技术有限公司

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