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    酶联免疫法实验

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        上海樊克生物

      酶联免疫吸附剂测定法,简称酶联免疫法,或者ELISA法。它的中心就是让抗体与酶复合物结合,然后通过显色来检测。
      由上海樊克生物提供,仅供参考!

      基本原理:
      ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。
      ② 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标 抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与 标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅来进行 定性或定量分析。由于酶的催化频率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。
      ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂:
      ①固相的抗原或抗体
      ②酶标记的抗原或抗体
      ③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。

      注意事项:
      ⒈ 正式试验时,应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件,待检样品应作一式二份,以保证实验结果的准确性。有时本底较高,说明有非特异性反应,可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
      ⒉ 在ELISA中,进行各项实验条件的选择是很重要的,其中包括:
      ⑴ 固相载体的选择:许多物质可作为固相载体,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。当前常用的是40孔聚苯乙烯 凹孔板。不管何种载体,在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被,在同一实验条件下进行反应,观察其显色反应是否均一性,据此判明其吸附性能是否良好。
      ⑵ 包被抗体(或抗原)的选择:将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时,要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0~9.6之间。吸附温度,时间及其蛋白量也 有一定影响,一般多采用4℃18~24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定:即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg/ml等)进行包被后,在 其它试验条件相同时,观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1~10μg/ml。
      ⑶ 酶标记抗体工作浓度的选择:首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
      ⑷ 酶的底物及供氢体的选择:对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应,而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用,应注意防护。有条 件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体,如TMB和ABTS是当前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后,应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间, 以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制,尤其是H2O2在临用前加入。


      检测步骤:
      ELISA用血清来检测,首先 血液要经过至少半个小时的凝集,然后取血清。将酶复合物用稀释液稀释后,加血清及阴性、阳性对照,还有就是质控品(这是严格的要求,它的范围必须在质控范 围内)。经过一个小时的孵育,然后洗板,加底物,半个小时避光反应后加终止液即完成反应部分,然后就是读数。由数值来判断结果的阴性或阳性。

      用于标记的酶:
      用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性:有高度的活性和敏感性;在室温下稳定;反应产物易于显现;能商品化生产。当前应用较多的有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等,其中以HRP应用最广。[1]
      过氧化物酶
      过 氧化物酶广泛分布于植物中,辣根中含量最高,从辣根中提取的称辣根过氧化物酶(HRP),是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白(含糖量 18%),分子量约40 000,约由300个氨基酸组成,等电点为pH 3-9,催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异,一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的(NH42SO4溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。
      酶的纯度以RZ表示:RZ=OD403/OD275
      纯 酶的RZ多在3.0以上,最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶,非酶蛋白约占 75%,不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢,催化反应时的供氢体有几种:(1)邻苯二胺(OPD),产物为橙 色,可溶性,敏感性高,最大吸收值在490nm,可用肉眼观察判别,容易被浓H2SO4终止反应,颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中最常用 的一种;(2)联大茴香胺(OD),产物为橘黄色,最大吸收值在400nm,颜色较稳定;(3)5-氨基水杨酸(5-AS):产物为深棕色,最大吸收值在 449nm,部分溶解,敏感性较差;(4)邻联    胺(OT)产物为蓝色,最大吸收值在630nm,部分溶解,不稳定,不耐酸,但反应快,颜色明显。
      碱性磷酸酶
      系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取,由多个同功酶组成。它们的底物种类很多,常用者为    磷酸盐,廉价无毒性。酶解产物呈黄色,可溶,最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反应系统中,37℃1分钟水解1μg磷酸苯二钠为一个单位。

      酶标记法:
      酶 与抗体交联,常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行,标记效果好,特别适用于实验室的小批量制备。其标记程 序为:将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中,加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠(NaIO4)水溶液0.5ml,混匀置4℃冰箱30分钟 , 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml,室温放置30分钟后加入含5(g纯化抗体的水溶液1ml,混匀并装透析袋,以0.05mol/L、 pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时(或过夜)使之结合,然后吸出,加     (NaBH4)溶液( 5(g/ml)0.2ml,置4℃冰箱2小时,将上述结合物混合液加入等体积饱和    (NH42SO4溶液,置4℃冰箱30分钟后离心,将所得沉淀物溶于少许 0.02mol/L、pH7.4PBS中,并对之透析过夜(4℃),次日离心除去不溶物,即得到酶标抗体,用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至 5ml,进行测定后,冷冻干燥或低温保存。

      效果测定:
      酶标抗体标记效果测定:测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。
       
      温馨提示:不可用于临床治疗。

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