酶联免疫吸附剂测定法，简称酶联免疫法，或者ELISA法。它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。由上海樊克生物提供，仅供参考！基本原理：
①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
② 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标 抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与 标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行 定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：
①固相的抗原或抗体
②酶标记的抗原或抗体
③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
注意事项：
⒈ 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
⒉ 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括：
⑴ 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。当前常用的是40孔聚苯乙烯 凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
⑵ 包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也 有一定影响，一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg/ml等）进行包被后，在 其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。
⑶ 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
⑷ 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条 件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是当前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间， 以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。
检测步骤：
ELISA用血清来检测，首先 血液要经过至少半个小时的凝集，然后取血清。将酶复合物用稀释液稀释后，加血清及阴性、阳性对照，还有就是质控品（这是严格的要求，它的范围必须在质控范 围内）。经过一个小时的孵育，然后洗板，加底物，半个小时避光反应后加终止液即完成反应部分，然后就是读数。由数值来判断结果的阴性或阳性。
用于标记的酶：
用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。当前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。[1]
过氧化物酶
过 氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量 18%），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的（NH
4）
2SO
4溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。
酶的纯度以RZ表示：RZ=OD403/OD275
纯 酶的RZ多在3.0以上，最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占 75%，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：（1）邻苯二胺（OPD），产物为橙 色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓H2SO4终止反应，颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中最常用 的一种；（2）联大茴香胺（OD）,产物为橘黄色，最大吸收值在400nm，颜色较稳定；（3）5－氨基水杨酸（5－AS）：产物为深棕色，最大吸收值在 449nm，部分溶解，敏感性较差；（4）邻联 胺（OT）产物为蓝色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，但反应快，颜色明显。
碱性磷酸酶
系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。它们的底物种类很多，常用者为 磷酸盐，廉价无毒性。酶解产物呈黄色，可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反应系统中，37℃1分钟水解1μg磷酸苯二钠为一个单位。
酶标记法：
酶 与抗体交联，常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。其标记程 序为：将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠（NaIO4）水溶液0.5ml，混匀置4℃冰箱30分钟 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30分钟后加入含5(g纯化抗体的水溶液1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L、 pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时（或过夜）使之结合，然后吸出，加 （NaBH4）溶液（ 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和 （NH
4）
2SO
4溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许 0.02mol/L、pH7.4PBS中，并对之透析过夜（4℃），次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至 5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。
效果测定：
酶标抗体标记效果测定：测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。
温馨提示：不可用于临床治疗。
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