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      • 提供商:

        沃登医学

      • 服务名称:

        RNAi

       
      RNAi

      一、RNAi服务介绍
       
      研究表明,将与mRNA同源的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞,可以使mRNA发生特异性的降解,从而抑制其相应基因的表达。这种转录后基因沉默机制(Post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰(RNAi)。由于RNAi具有高度的序列专一性,可以特异地使特定基因沉默,获得功能丧失或降低突变,因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具,用于功能基因组的研究。

      我们应用国外知名公司的RNAi Designer平台,可对靶基因序列进行干扰位置效应评价和序列同源型分析,完成siRNA/miRNA多种序列的的设计,并提供从siRNA合成、RNAi载体构建到RNAi功能验证等全面的RNAi解决方案。

       

      二、服务内容:
       
      1、siRNA合成: 
      对于瞬时基因沉默实验,化学合成siRNA的方法操作简便,容易获得高水平的瞬时沉默效果,特异性强。我们通过严格设计来增强siRNA的专一性;针对某靶基因设计的3条siRNA可保证其中两条的Knockdown效率达到75%(染效率大于80%的情况下)。

      实验流程: 
      1)根据序列信息,进行化学合成 ;
      2)纯化及定量 ;
      3)冻干处理 ;
      4)细胞转染预实验,优化转染条件; 
      5)瞬时转染或稳定转染 ;
      6)RT-PCR或Western blot检测转染后某一时间点靶基因的RNA水平或蛋白水平的变化 。
       
      2、质粒载体shRNA的构建
      构建shRNA表达载体,实现shRNA在细胞中稳定表达,能够弥补瞬时转染持续时间短的不足。

      实验流程: 
      1)mRNA序列分析; 
      2)引物设计及合成; 
      3)单链互补引物退火; 
      4)将片段克隆至载体; 
      5)测序以确保插入序列正确性; 
      6)向客户提交测序结果与实验方法报告单。

      3、microRNA干扰载体构建:
      RNAi载体表达可以稳定地研究基因功能,载体在细胞种持续抑制靶基因的表达可达数星期甚至更久。 RNAi载体利用细胞内源性的miRNA加工机制,相比传统shRNA载体可更高效地表达RNA发夹结构。每个基因设计的4条序列,我们保证至少有2条可以达到至少70%转录水平的Knockdown效率(在转染效率大于80%的情况下)。 

      实验流程:
      1)针对特定基因,设计micro RNAi序列,合成该序列并退火生成双链DNA;
      2)将DNA与载体连接并转化 ;
      3)测序验证miRNA序列的正确性 ;
      4)细胞转染预实验,优化转染条件 ;
      5)瞬时转染或稳定转染 ;
      6)RT-PCR或Western blot检测转染后某一时间点靶基因的RNA水平或蛋白水平的变化。

      4、RNAi干扰效果检测:
      应用RT-PCR方法检测mRNA水平的基因敲除效果;通过Western blot方法检测蛋白水平的基因敲除效果。
       


      三、服务说明 

      1siRNA合成

      客户提供:
      1)目的基因的Accession Number(Human、Mouse或Rat种属)以及技术要求(包括OD和nmols的精确数量、纯化类型和修饰要求等) 
      2)细胞株和详细的细胞培养的操作步骤 
      3)一抗(如果需要Western blot检测)

      注:普通siRNA:均有HPLC纯化,100%除去尚未配对的单链 ;化学修饰siRNA:利用修饰以提高siRNA在血清和培养基种的稳定性;荧光标记siRNA;siRNA对照:普通阴性对照、荧光标记的阴性对照(易观察,可观察转染效率)和siRNA阳性对照(作为一个实验系统检查,确保在您的实验方法是可靠的;
       
      2、质粒载体shRNA的构建 

      客户提供: 待研究mRNA序列信息。 
       
      3microRNA干扰载体构建

      客户提供: 
      1)目的基因的Accession Number(Human、Mouse或Rat种属) 
      2)细胞株和详细的细胞培养的操作步骤 
      3)一抗抗体(如果需要Western blot检测)
       
      4、服务价格与周期:


      四、质量承诺: 

      1、siRNA合成:
      1)转染效率分析 ;
      2)Knockdown结果。
      针对靶基因设计的3条siRNA可保证其中2条的Knockdown效率达到75%(在转染效率大于80%的情况下)。

      2、质粒载体shRNA的构建:
      1)阳性克隆质粒;
      2)阳性克隆甘油菌;
      3)测序报告以及实验方法报告。

      3、microRNA干扰载体构建:
      1)构建好的表达载体和相应的甘油菌;赠送阴性对照甘油菌 ;
      2)测序报告 ;
      3)转染效率分析 ;
      4)Knockdown结果。
      针对某靶基因设计的3条miRNA序列,在转染效率 > 80%的前提下,我们保证至少有1个克隆可以达到70%转录水平的沉默效率服务流程 。

       
       

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