DRNAzolTM血清病毒DNA/RNA提取试剂盒使用说明书
本试剂盒由裂解液、蛋白沉淀液组成。可同时从血清中提取病毒DNA和RNA基因组。整个提取过程不超过45分钟。提取过程包括:1裂解血清中的病毒颗粒。2盐析沉淀蛋白,分离DNA和RNA。3异丙醇沉淀脱盐并浓缩。4 70%乙醇清洗,晾干并用DNA和RNA溶解液溶解。裂解液中含有抑制DNA酶和RNA酶的成分,在加热(65°C)状态下,可保证完整的病毒DNA和RNA的充分裂解释放,异丙醇沉淀时,罕见浑浊的蛋白质杂质的共沉淀。提取血清DNA和RNA可用于PCR扩增、内切酶消化以及膜杂交等。
一、 试剂盒组成(本试剂盒提供的组份, 至少可提取100份100ul血清样本的DNA,每种组份均有足够的富余量)
1. 复合裂解液:20ml´1瓶。
2. 蛋白沉淀液:20ml´1瓶。
3. 操作说明书一份。
二、 本试剂盒未提供,须用户自备的试剂为:DEPC处理的超纯水,DEPC处理的EP离心管及家养枪头,异丙醇,70%乙醇(国产分析纯)。
三、 血清病毒DNA和RNA提取操作准备:
1. 样本要求:用于提取的血清样本,样本在-20°C存放一周以内,避免反复冻融。4°C存放3天以内,均能纯化出高质量的DNA和RNA。-80°C条件下,样本至少可存放一年。
2. 血清需求量:根据需要,本试剂盒每200ul裂解液,可提取20-100ul血清病毒DNA和RNA。如果按照每份提取血清100ul来计算,总共可以提取100份血清,提取试剂各组份用量与血清提取量的对应关系见下面表格。
四、 提取操作:以下按照提取100ul血清病毒DNA和RNA来说明:
1. 将复合裂解液置65°C水浴加热,使结晶成分溶解,准备1.5-2ml离心管,每个离心管中分装加入200ul的裂解液。
2. 分别向每个单管中加入100ul血清样本;混璇器震荡混匀10秒,置65°C水浴中反应20分钟。
表1:提取血清病毒DNA/RNA用量与组份用量对应表:
血清 |
复合裂解液 |
蛋白沉淀液 |
异丙醇 |
70%乙醇 |
DNA溶解液 |
离心管容积 |
100ul |
200ul |
200ul |
400ul |
200ul |
25ul |
1.5-2ml |
3.各管中加入200ul蛋白沉淀液。上下颠倒5-6次使两者混匀。
4. 13000-16000×g, 离心3-5分钟。
5. 将上清液(约400ul)用DEPC水处理的家养枪头,转移至新的DEPC水处理的离心管中,加入等体积异丙醇,混匀后离心,同步骤5,倾去上清。
6. 离心管中加入200ul,70%的乙醇溶液,来回倒置,清洗管壁,离心同上。
7. 移去70%乙醇,倒置离心管于干净的滤纸上,自然干燥10-15分钟,按上表量加入DEPC处理的超纯水溶解液。
8. 快速漩涡震荡1-2秒,使DNA溶解液冲刷到所有沉淀的DNA/RNA。
9. 病毒DNA/RNA可直接进行PCR等下一步操作。
四、注意事项:
提取的病毒DNA/RNA样本在70%乙醇中,存于-80ºC,可长期保存。2. 为保证RNA的完整性,所用的枪头,离心管等均需事先经过DEPC水处理,灭菌后再用。如果单独针对病毒DNA进行提取,可用TE buffer代替DEPC处理水。
五、储存条件:本试剂盒在室温条件下可保存两年。
六、附图:HCV阳性血清经过本试剂盒纯化后,两步法PCR扩增的375bp片段后电泳的比较