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Trizol(总RNA抽提试剂)

Trizol(总RNA抽提试剂)

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  • 货号: NR0002
    保存条件: 4℃ 避光
    供应商: LEAGENE
    英文名: Trizol Reagent
    保质期: 12个月
    规格: 100ml
    Trizol(总RNA提取试剂)
    产品简介:
    Trizol是一种新型的用于细胞或组织的总RNA提取试剂,Leagene Trizol采用与Invitrogen TRIzol完全相似的原理和方法,其颜色、抽提的方法和步骤与后者完全相同。Leagene Trizol含酚和胍盐等物质,能迅速裂解细胞或组织并且灭活核酸酶,保持RNA的完整性。加入氯仿并离心后,溶液形成上清层为水相(无色)、中间层、下层为有机相(红色)。上清层用异丙醇沉淀回收总RNA,中间层用乙醇沉淀回收DNA,下层用异丙醇沉淀回收蛋白。
    Leagene Trizol适用于从各种组织或细胞中快速分离总RNA,既可用于小量样品(50~100 mg组织、5×106细胞),也可用于大量样品(>1g组织/>107细胞)。提取的总RNA质量高,可用于Northern blot、Dot blot、polyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆。本产品具有以下特点:①适用范围广;②操作简单,整个过程1小时内完成;③纯度高;④污染少。
     
    产品组成:
                         编号     
    名称
    NR0002 Storage
    Trizol Reagent  100ml 4℃ 避光
    使用说明书 1份
     
     
     
     
     
    自备材料:
    1、试剂:无水乙醇、氯仿、异丙醇、DEPC处理水等。
    2、耗材: RNase广泛存在于人的皮肤上和体液及环境中,RNase是导致RNA降解的最主要物质,非常稳定。操作时应佩戴一次性口罩、手套、帽子。塑料制品、玻璃和金属物品、实验仪器等应清除RNase,移液器吸头、EP管等制品的RNase free处理尤为重要。
    3、仪器:低温高速离心机、低温冰箱。
     
    操作步骤(仅供参考)
    1、 样品准备
    ⑴贴壁细胞:
    ①直接裂解:直接在培养瓶/皿中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml Trizol,用移液器吹打混匀。
    ②胰蛋白酶消化:用无菌PBS洗涤细胞后,加入含有0.05~0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞,当细胞脱离容器壁后,加入含有血清的培养基终止反应,将细胞溶液转移至无RNase的离心管中,5000~6000g离心5 min,收集细胞沉淀,去除上清。收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净,否则裂解不完全,降低RNA收获率。 
    ⑵悬浮细胞:无需清洗细胞,直接5000~6000 g离心5 min,收集细胞。每5×106~107动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加入1ml Trizol。
    ⑶组织:取新鲜动物或者植物组织或者-70℃冻存组织,50~100mg组织在液氮中充分研磨或者加入1ml Trizol研磨或者用匀浆器匀浆处理。样品体积一般不超过Trizol体积的10%。研磨要迅速,以1min为佳。
    ⑷血液:取0.5~1 ml新鲜或冻存的血液,12000g离心5 min,去除血浆,加入1ml Trizol,充分振荡混匀。
    2、 核酸分离:充分振荡混匀(可以置于低温/超低温冰箱冻存5~10 min后,充分振荡,反复1~3次),将裂解样品或匀浆液室温放置5~10 min,使核蛋白与核酸完全分离。
    3、 样品分层:加入0.2 ml氯仿/1ml Trizol,剧烈振荡15 s,室温放置2~3 min。置于4℃离心机,12000 g离心10~15 min。上层为水相,中间层和下层为有机相,RNA在上层水相。
    4、 沉淀RNA:吸取上层水相(约500μl)转移至无RNase的离心管中(不要吸取任何中间层物质,否则会有染色体DNA污染),加入等体积异丙醇混匀(或者加入1.2倍体积Leagene Trizol专用RNA沉淀液,超低温冰箱放置2~3hr,可以大大提高RNA回收率),室温放置15~20 min。12000 g 4℃离心10 min,离心后管侧或管底形成胶状沉淀,弃上清。
    5、 洗涤RNA:加入1ml DEPC水配制的75%乙醇/1ml Trizol洗涤沉淀(或者加入1ml Leagene Trizol专用RNA洗涤液,可以大大提高RNA纯度),室温放置5~10 min,7500g 4℃离心5 min,弃上清。室温干燥5~10 min,不宜过分干燥,否则RNA难以溶解。
    6、 溶解RNA:加入30~50ul RNase-free ddH2O充分溶解RNA,-70℃长期保存或直接用于后续试验。对于肝、胰腺、肾等组织中RNase含量高的样品,沉淀时用100%去离子甲酰胺溶解。
     
    分析与定量:
    1. 测定样品在260 nm和280 nm的吸收值确定RNA的质量。按1OD=40pg RNA计算RNA的产率。OD260/280在1.8~2.0视为抽提RNA纯度较好。浓度在4μg/ml以上的样品适于用分光光度计测定。
    2. 进行甲醛变性琼脂糖电泳,确定RNA的完整性和污染情况。
    3. 核酸分析仪测定RNA的质量和纯度。
     
    注意事项:
    1、 样品保存:加入Trizol混匀后,样品可在-70℃放置1~2月;RNA样品可以在70%酒精中-70℃保存2~4周:如果需要长期保存,应置于超低温冰箱中保存。
    1. Trizol是强腐蚀性物质,污染皮肤或眼睛后,立即用清水或生理盐水冲洗,必要时寻求医生的帮助。
    2. Trizol可常温运输,建议保存4℃保存。
    3. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
     
    有效期:12个月有效。
     
    常见问题分析:
    常见问题 可能原因
     
     
    A260/ A280<1.6
    抽提得到的RNA沉淀未完全溶解。
    水相中混有有机相,从而存在蛋白质和DNA污染。
    RNA样品用水而不是TE溶解。低离子浓度和低pH条件下,A280值会偏高。
    样品匀浆时加的Trizol试剂太少,RNA与蛋白质、DNA未能完全分离。
    匀浆后样品未在室温放置或者放置时间太短,RNA与核蛋白未完全解离。
     
    DNA污染
    样品中含组织溶剂(如乙醇等)或碱性溶液,致水相减少或pH升高。
    样品匀浆时加入的试剂体积太少。如果存在DNA污染,可用DNA清除剂去除。
    水相中混有有机相,从而存在蛋白质和DNA污染。
     
    RNA产量低
    样品裂解或匀浆处理不彻底,RNA没有被完全释放出来。
    得到的RNA沉淀未完全溶解。
    抽提的RNA中含有RNase。
     
    RNA降解
    组织或细胞不新鲜,样品没有及时被液氮冻存,导致组织或细胞中的RNA降解。
    溶液或离心管未经RNase free处理,RNase的污染导致RNA被降解。
    细胞在胰蛋白酶消化时间过长,导致未加Trizol前RNA已经部分降解。
    电泳时使用的甲酰胺pH小于3.5,导致RNA发生酸解。
    蛋白和多糖污染 水相中混有有机相,从而带有蛋白质和DNA。
    样品中蛋白、多糖含量高或样品量太大,细胞未裂解完全。
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